多吡啶類雙核鎳配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及抗癌活性

喬佩佩 田玥瑋 賀 卿 張永坡 高春艷＊, 趙晉忠 杜維俊

(1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部，晉中 030801)

(2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，晉中 030801)

自從順鉑被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性以來，其衍生物如卡鉑、奧沙利鉑、樂鉑等被迅速研發(fā)并被廣泛用于治療癌癥，這使得金屬配合物在眾多靶向抗腫瘤藥物中脫穎而出，得到了人們的廣泛關(guān)注[1-2]。但隨著臨床應(yīng)用的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)鉑類藥物在帶來抗癌作用的同時(shí)伴隨著對(duì)身體各種器官的毒副作用，且極易產(chǎn)生耐藥性，這在很大程度上限制了鉑類配合物的生物利用度和臨床應(yīng)用[3-4]。鉑類抗癌藥的這些缺點(diǎn)促使人們嘗試用其他過渡金屬配合物替代它們[5-7]，因此，研發(fā)低毒、高效且不易產(chǎn)生耐藥性的新型金屬配合物對(duì)于癌癥治療具有重要的理論意義。

過渡金屬鎳作為人、動(dòng)物、微生物和植物生命過程中一種必需的微量元素，能促進(jìn)紅細(xì)胞再生及造血功能，參與體內(nèi)多種酶的組成，對(duì)人體內(nèi)的各種生理反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用[8-10]。近些年來，有關(guān)鎳配合物在生物無機(jī)化學(xué)研究中的報(bào)道逐漸增加，其顯示出多種生物活性，例如抗驚厥、抗真菌、抗微生物、抗氧化以及抗腫瘤活性[11-16]。而多吡啶類配體作為現(xiàn)代配位化學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的螯合配體，由于其具有σ給電子能力以及π受電子能力，能夠與多種過渡金屬形成穩(wěn)定的配合物，因此具有良好的應(yīng)用前景[17-20]。

據(jù)此，我們以含氮多齒吡啶N，N-bis(pyridin-2-ylmethyl)-4-(4-((pyridin-2-ylmethyl)amino)benzyl)aniline(L)作為配體，合成了2個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的多吡啶雙核鎳配合物[Ni2(L)2Cl2](ClO4)2·3H2O(1)和[Ni2(L)2Cl2](PF6)2(2)。利用X射線單晶衍射、紅外光譜以及元素分析確定了該配合物的晶體結(jié)構(gòu)并進(jìn)行表征。對(duì)其作為潛在抗癌藥物的特性進(jìn)行了研究：2個(gè)配合物的體外抗增殖活性通過對(duì)4種癌細(xì)胞系(HeLa、BGC-823、NCI-H460和HepG-2)的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究；此外通過Hoechst 33342染色、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平檢測(cè)、線粒體膜電位測(cè)定等技術(shù)和方法探究了配合物抗腫瘤活性的作用機(jī)制。

Scheme 1 Structure of L

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、溴化噻唑藍(lán)四氮唑(噻唑藍(lán)，MTT)、Hoechst 33342染色試劑、DCFH-DA探針、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒均購自索萊寶公司，二甲基亞砜(DMSO)購自阿拉丁公司。其余試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

所用儀器有Perkin-Elmer 240型元素分析儀(C、H、N)、Bruker Smart1000單晶衍射分析儀、酶標(biāo)分析儀DNM-9602(北京普朗新技術(shù)有限公司)、倒置光學(xué)顯微鏡DMIL LED(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司)、超凈工作臺(tái)SW-CJ-1D(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Galaxy 170 S New Brunswick)。

1.2 配合物的合成

配體L的合成參見文獻(xiàn)[21]。

配合物1的合成：稱取0.2mmol的配體L溶于15mL無水乙醇中，完全溶解后滴加0.2mmol的三乙胺。然后緩緩滴加Ni(ClO4)2·6H2O(0.2mmol)的水溶液(5m L)至上述溶液中，混合液在室溫?cái)嚢?0 h后過濾，濾液在干凈燒杯中靜置。緩慢揮發(fā)一段時(shí)間后，適合X射線單晶衍射分析的藍(lán)綠色塊狀晶體從溶液中析出，過濾，將晶體用少量冷乙醚淋洗，干燥后稱重，產(chǎn)率：35%。元素分析按C62H62Cl4N10Ni2O11計(jì)算的理論值(% )：C，53.87；H，4.52；N，10.13。實(shí)驗(yàn)值(% )：C，53.90；H，4.55；N，10.06。FT-IR(KBr，cm-1)：3 442，3 269，1 610，1 574，1 513，1 488，1 447，1 219，1 098，1 021，811，625。

配合物2的合成：稱取0.2mmol的配體L溶于15mL無水甲醇中，攪拌并逐滴加入0.2mmol的三乙胺，緩慢加入NiCl2·6H2O(0.2 mmol)的甲醇溶液(10mL)，混合液加熱攪拌回流0.5 h后，繼續(xù)加入0.2 mmol KPF6，繼續(xù)回流3 h，有大量綠色沉淀析出，過濾。將綠色沉淀用5mL乙腈、5mL甲醇、5mLN，N-二甲基甲酰胺和5mL水復(fù)溶，過濾，濾液在室溫下靜置10 d后，適合X射線單晶衍射的藍(lán)綠色塊狀晶體析出。將晶體過濾并用少量冷乙醚淋洗，干燥后稱重。產(chǎn)率：31%。元素分析按C62H58Cl2F12N10Ni2P2計(jì)算的理論值(% )：C，52.39；H，4.11；N，9.85。實(shí)驗(yàn)值(% )：C，52.42；H，4.17；N，9.80。FT-IR(KBr，cm-1)：3 270，1 611，1 575，1 514，1 488，1 448，1 218，1 098，932，844，625。

1.3 配合物的晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定

選取配合物1和2的單晶樣品(尺寸均為0.40 mm×0.25mm×0.20mm)置于Bruker Smart 1000 CCD單晶衍射儀上，在低溫(配合物1)或室溫(配合物2)下，采用經(jīng)石墨單色化的MoKα輻射作為衍射光源(λ=0.071 073 nm)，以φ-ω掃描方式收集衍射點(diǎn)，通過SAINT程序進(jìn)行數(shù)據(jù)還原，強(qiáng)度數(shù)據(jù)經(jīng)SADABS程序校正[22]。用SHELXS-97程序的直接法解析結(jié)構(gòu)[23-24]。對(duì)全部非氫原子坐標(biāo)及其各向異性熱參數(shù)用SHELXL-97程序進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正；氫原子均為理論加氫并進(jìn)行跨式模型(riding model)精修。配合物1和2的晶體學(xué)數(shù)據(jù)見表1，部分鍵長鍵角數(shù)據(jù)見表2。

表1 配合物1和2的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data of Complexes1 and 2

表2 配合物1和2的部分鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)of complexes1 and 2

續(xù)表2

CCDC：2058250，1；2058251，2。

1.4 配合物的抗癌活性檢測(cè)

1.4.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件

人宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)、人胃癌細(xì)胞系(BGC-823)、人肺癌細(xì)胞系(NCI-H460)、人肝癌細(xì)胞系(HepG-2)由天津醫(yī)科大學(xué)科研平臺(tái)提供。HeLa細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM(H)高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，其它細(xì)胞用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)

采用MTT法來評(píng)估2個(gè)配合物的體外抗腫瘤活性。將細(xì)胞接種于 96孔(每孔3×103～5×103個(gè))細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱(37℃，體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2)中孵育24h。除去舊的培養(yǎng)基，換入新鮮培養(yǎng)基，設(shè)定空白組、對(duì)照組(未加配合物組)、加藥組(配合物終濃度分別為 3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)，分別加入相對(duì)應(yīng)的藥物后繼續(xù)孵育48 h，然后每孔中加入20μLMTT(5mg·mL-1)繼續(xù)孵育4 h。取出培養(yǎng)板并吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min后使用酶標(biāo)儀對(duì)其吸光度進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算IC50值。

1.4.3 Hoechst 33342染色

Hoechst 33342是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，常用于細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)，從而證明化合物是否通過誘導(dǎo)凋亡的方式來殺死腫瘤細(xì)胞[25]。取對(duì)數(shù)期且生長狀態(tài)良好的NCI-H460細(xì)胞接種于 12 孔板(每孔 3×104～5×104個(gè))，置于培養(yǎng)箱(37℃，體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2)中孵育24h。分別加入一定濃度的配合物1于12孔板中，并設(shè)置相應(yīng)對(duì)照組，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，吸去培養(yǎng)基并用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)清洗2～3次，每次3 min，加入Hoechst 33342(10 μg·L-1)染液，置于培養(yǎng)箱中避光孵育15min，棄去染液并用PBS清洗2～3次，每次3min，置于熒光倒置顯微鏡選取合適的視野進(jìn)行觀察并拍照。

1.4.4 ROS水平檢測(cè)

ROS的產(chǎn)生和堆積是細(xì)胞凋亡中的重要事件，因此細(xì)胞生長過程中ROS的產(chǎn)生可以作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的重要特征之一。我們利用凋亡細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧可以將沒有熒光的DCFH氧化生成具有綠色熒光的DCF這一特征來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平[26]。取處于對(duì)數(shù)期且生長狀態(tài)良好的NCIH460 細(xì)胞接種于 12孔板(每孔 3×104～5×104個(gè))中，置于培養(yǎng)箱(37℃，體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2)中孵育24 h。在細(xì)胞中加入不同濃度的配合物1繼續(xù)孵育24 h，吸出上清液，將用無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA探針(10μmol·L-1)加入孔板中，置于培養(yǎng)箱中避光染色30min，取出后用PBS洗滌3次，每次3min，然后置于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，選取合適的視野并拍照。

1.4.5 線粒體膜電位檢測(cè)

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程通常分為內(nèi)源性(線粒體)、外源性(死亡受體)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)3條通路，其中線粒體通路最為常見。大量研究表明在凋亡過程中一旦線粒體膜電位下降，則細(xì)胞將會(huì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡[27-28]。采用JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)，通過紅綠熒光的變化來判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。其基本步驟為取對(duì)數(shù)期且生長狀態(tài)良好的NCI-H460細(xì)胞接種于12孔板(每孔3×104～5×104個(gè))中，置于培養(yǎng)箱(37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2)中孵育24 h,在細(xì)胞中加入不同濃度的配合物1繼續(xù)孵育24 h，按照試劑盒步驟進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的結(jié)構(gòu)及其表征

對(duì)2個(gè)配合物進(jìn)行表征發(fā)現(xiàn)，配合物1屬于正交晶系，P21212手性空間群，F(xiàn)lack因子為0.04(3)。晶體解析結(jié)果表明，1的每個(gè)Ni中心均為六配位模式，該雙核配合物由2個(gè)不對(duì)稱的L形成雙鏈螺旋分子盒狀，其基本單元是由1個(gè)[Ni2(L)2Cl2]2+與外界的2個(gè)ClO4-和3個(gè)水分子構(gòu)成。而配合物2與1的配位模式相同，結(jié)構(gòu)相似，兩者主要區(qū)別在于外界陰離子、配位原子與中心原子之間的空間排列不同以及空間群不同，2為非手性的Pbcn，晶體2也屬于正交晶系，其基本單元是由1個(gè)[Ni2(L)2Cl2]2+和外界的2個(gè)PF6-構(gòu)成。2個(gè)配合物的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 配合物1和2的晶體結(jié)構(gòu)Fig.1 Crystal structures of complexes1 and 2

由圖1可見，1和2的Ni中心的配位原子由一個(gè)L的叔胺N原子、2個(gè)吡啶N原子及另一個(gè)L中的1個(gè)仲胺N原子、1個(gè)吡啶N原子和1個(gè)Cl原子組成，因此其構(gòu)型可描述為畸變的八面體。L的二苯基甲烷基團(tuán)中的—CH2—是柔性的，在配合物1中C2—C1—C29A的鍵角為110.6(5)°，Ni1和Ni1A之間的距離為 1.052 5 nm；而配合物2中C28—C31—C4A的鍵角為109.8(4)°，Ni1和Ni1A之間的距離為0.997 1 nm。

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

以順鉑作為陽性對(duì)照，對(duì)2個(gè)化合物進(jìn)行體外抗腫瘤活性檢測(cè)(表3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)鎳配合物對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞的毒性均高于配體，這說明配體與Ni2+的配位明顯增強(qiáng)了配體原有的抗癌活性。在2個(gè)配合物中，配合物1對(duì)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更高的毒性作用，其中對(duì)NCI-H460毒性作用最強(qiáng)，IC50=(26.0±2.2)μmol·L-1，因此我們選擇配合物1對(duì)NCIH460細(xì)胞的抗腫瘤作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表3 配合物1和2及配體L對(duì)測(cè)試細(xì)胞系的IC50值Table 3 IC50values of complexes1,2 and ligand L toward the tested cell lines

2.3 凋亡形態(tài)檢測(cè)

利用Hoechst 33342染色法檢測(cè)了配合物1對(duì)NCI-H460細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果如圖2所示?？梢钥吹剑瑢?duì)照組細(xì)胞呈淺藍(lán)色或者沒有顏色；陽性對(duì)照組(順鉑)細(xì)胞染色加深、變亮，而且出現(xiàn)皺縮；而加藥組的細(xì)胞隨著濃度增大，細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的深藍(lán)色，并伴隨著一定的皺縮，在高濃度組中細(xì)胞皺縮明顯增多。由此可以判定，配合物是以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式[23]對(duì)NCI-H460細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，且具有一定的濃度依賴性。

圖2 Hoechst 33342染色法檢測(cè)配合物1對(duì)NCI-H460細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effect of complex 1 on morphology of NCI-H460 cells determined by Hoechst 33342 staining method

2.4 ROS檢測(cè)

如圖3所示，在對(duì)照組中，由于低的ROS水平，DCHF-DA難以轉(zhuǎn)變成具有綠色熒光的DCF，因此觀察到微弱的綠色熒光斑點(diǎn)；當(dāng)把NCI-H460細(xì)胞暴露于不同濃度的配合物1中孵育24 h后，DCHF-DA在高水平的ROS下被轉(zhuǎn)變成具有綠色熒光的DCF，因此在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)許多明亮的綠色斑點(diǎn)，且具有一定的濃度依賴性。該結(jié)果表明，配合物1通過提高細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。

圖3 DCFH-DA探針染色法測(cè)定配合物1對(duì)NCI-H460細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響Fig.3 Effect of complex 1 on ROS production in NCI-H460 cells determined by DCFH-DA probe staining method

2.5 線粒體膜電位檢測(cè)

以上2個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，配合物1可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑來對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生致死作用，因此我們采用一種新型陽離子羰花青染料(JC-1)作為熒光探針測(cè)定了線粒體膜電位的變化。結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組NCI-H460細(xì)胞由于高的膜電位所以呈現(xiàn)紅色熒光，但隨著配合物1的加入，其紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強(qiáng)。從紅色到綠色熒光的變化表明配合物1的加入導(dǎo)致NCI-H460細(xì)胞線粒體膜電位降低，且具有明顯的濃度依賴性，據(jù)此推測(cè)該配合物很可能是通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27-28]。

圖4 JC-1探針染色法檢測(cè)配合物1對(duì)NCI-H460細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響Fig.4 Effect of complex 1 on mitochondrial membrane potential of NCI-H460 cells determined by JC-1 probe staining method

3 結(jié) 論

合成了2個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的雙核鎳（Ⅱ）配合物[Ni2(L)2Cl2](ClO4)2·3H2O(1)和[Ni2(L)2Cl2](PF6)2(2)并對(duì)其進(jìn)行表征。MTT實(shí)驗(yàn)表明配合物1和2對(duì)體外腫瘤細(xì)胞HeLa、BGC-823、NCI-H460及HepG-2均具有一定的細(xì)胞毒性，其中對(duì)于NCI-H460細(xì)胞毒性作用最強(qiáng)。進(jìn)一步探究了配合物1對(duì)NCI-H460細(xì)胞的毒性作用機(jī)制，結(jié)果表明，隨著配合物1濃度的遞增，細(xì)胞內(nèi)活性氧平衡遭到破壞，線粒體膜電位逐漸耗竭，說明該配合物很可能通過線粒體途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生致死作用。