兩株石油降解真菌生物學(xué)特性及降解能力研究

覃俊艷

（百色市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 百色 533000）

石油烴類污染物一旦流入海洋，對(duì)人類健康、海洋動(dòng)植物及微生物、旅游業(yè)等多方面都會(huì)造成嚴(yán)重危害，甚至威脅人類和動(dòng)物的生命。鑒于石油烴類污染的危害性大，這類污染防治引起了世界各國(guó)的重視。化學(xué)修復(fù)、物理修復(fù)、生物修復(fù)是當(dāng)前已知且常用的三大環(huán)境修復(fù)方式，其中生物修復(fù)技術(shù)具備污染少、效益高、投資低、風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)勢(shì)，是公認(rèn)的發(fā)展?jié)摿^大的環(huán)境修復(fù)方式，為解決復(fù)雜的環(huán)境污染問題提供了新思路。石油是一種復(fù)雜混合物，主要由鏈烷烴、芳香烴、環(huán)烷烴以及少量非烴化合物組成，是很多微生物的生長(zhǎng)所需要的碳源，甚至有些微生物是將其作為唯一碳源。這些微生物能通過氧化反應(yīng)將石油烴轉(zhuǎn)化為低分子化合物被生物體利用合成自身細(xì)胞成分，一些也可以氧化成CO2和H2O，循環(huán)進(jìn)入大氣。本課題的目的就是從自然海洋環(huán)境中篩選出能夠高效降解石油的菌株，從溫度、含油量、pH 值、菌液濃度等條件對(duì)這兩株菌進(jìn)行研究，優(yōu)化參數(shù)條件，提高降解效果，最終為生物修復(fù)石油烴污染提供理論和技術(shù)參考。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料的采集和處理

相關(guān)工作人員需要采集海水、海泥、海洋動(dòng)物、藻類等樣品，然后立即裝到無菌采樣袋中，低溫保存送回實(shí)驗(yàn)室及時(shí)處理。無菌稱取5g 樣品，放入無菌錐形瓶中，并倒入10 倍體積的無菌海水，旋渦振蕩，使其充分混勻制成懸濁液。

（二）菌種富集培養(yǎng)

無菌量取一種樣品的菌懸液10mL 加入裝有100mL 富集培養(yǎng)液的錐形瓶中，富集培養(yǎng)液包括三種：(Ⅰ)富集培養(yǎng)液Ⅰ(無機(jī)鹽培養(yǎng)液)：NaNO32g，K2HPO41.81g，MgSO4·7H2O0.1g；CaCl20.01g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，石油烴1%，pH 值為7；(Ⅱ)富集培養(yǎng)液Ⅱ(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，石油烴0.5%，pH 值為7；(Ⅲ)富集培養(yǎng)液Ⅲ(馬丁氏培養(yǎng)液)：0.03%孟加拉紅100mL，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，石油烴0.5%，pH 值為7；培養(yǎng)液和培養(yǎng)基均用陳海水配制，石油烴：柴油體積比1:4。在28℃環(huán)境下，連續(xù)振蕩培養(yǎng)7 天，之后取其上清液10mL，轉(zhuǎn)接入新鮮相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中。上述步驟需要被連續(xù)重復(fù)，直到完成富集培養(yǎng)2 次。以相同的方法富集培養(yǎng)其他樣品中的微生物。

（三）菌株純化

1.稀釋涂布平板法：將菌懸液于無菌海水中，按1 ∶9(V/V)比例稀釋，分別將稀釋度為10-3，10-4，10-5 的稀釋液，吸取20uL 注入PDA 平板和馬丁氏平板中，涂布，倒置培養(yǎng)7 天，接下來進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)，同時(shí)觀察記錄菌落特征和鏡檢。2.平板劃線分離法。稀釋涂布平板法效果不理想則考慮使用此種方法。

（四）菌株馴化

在富集培養(yǎng)液Ⅱ中增加石油烴的濃度，梯度為0.7%、0.9%、1.0%，加入菌液50uL 到盛有5mL 的試管中，30℃下振蕩培養(yǎng)7 天，振蕩頻率為160r/min。一個(gè)周期后將步驟重復(fù)，繼續(xù)30℃振蕩培養(yǎng)7 天。

（五）石油含量與降解率測(cè)定方法

1.采用紫外分光光度法測(cè)定石油含量。用石油醚作為石油萃取劑，用紫外分光光度計(jì)在200～300nm 處掃描，吸收峰出現(xiàn)在227nm 處，因此選用227nm 進(jìn)行分析可提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及靈敏度。2.菌種菌懸液的配制。觀察馴化結(jié)果，選取出降解較明顯的菌種。依次稀釋至適當(dāng)濃度，然后將適當(dāng)濃度的菌液滴加在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)數(shù)值配制菌液濃度為2.6-3.0×108 個(gè)/mL。3.菌種降解率的測(cè)定。分別配制石油烴的濃度為0.5%、0.7%、0.9%的培養(yǎng)液Ⅱ和PDA 培養(yǎng)液，取1.0mL 分離馴化得到的效果較好的純菌株分別接入到含20mL 的上述培養(yǎng)液的100mL 的錐形瓶中，在30℃，160r/min 的條件下培養(yǎng)6d。同時(shí)，不加菌液做空白對(duì)照。

分別在錐形瓶中加入2.0mL 的硫酸(1:3)，2.0mL 的正己烷，然后全量轉(zhuǎn)入梨形分液漏斗（60mL）中，之后在漏斗中加入正己烷3.0mL，并振蕩2min(注意放氣)，最后靜置分層。待分層之后，將下層水樣放入原瓶中。漏斗頸內(nèi)的水分要用濾紙卷吸干。將正己烷萃取液放入比色管中，比色管容量為10mL，并帶刻度。振蕩原樣瓶，將萃取過的水樣倒回分液漏斗中，加入5.0mL 的正己烷重復(fù)萃取一次，將萃取液合并于帶刻度的比色管中，用正己烷定容至標(biāo)線。

采用紫外分光光度法測(cè)定原樣中石油烴的含量。降解率計(jì)算公式：降解率(%)=(A0—A)/A0，A0——對(duì)照組測(cè)定殘油的吸光度值，A——待測(cè)樣中降解后殘油的吸光度值。

二、結(jié)果與分析

（一）初步鑒定：菌株F1 和F2 的鑒定

1.菌株F1 和F2 的菌落特征如下：

2.菌株顯微鑒定。在20 倍的顯微鏡下觀察兩個(gè)菌株兩次富集馴化培養(yǎng)后菌絲團(tuán)的圖片如下：

從菌株F1 和F2 的初次、再次富集圖片可以看出這兩個(gè)菌株降解石油的能力是可以通過馴化逐步提高的。

在40 倍顯微鏡下得到菌株F1 和F2 的顯微照片，見下圖：

從圖2.7 中，可以看到真菌F1 的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中有青霉的特征：孢子頂端膨起成掃帚狀。從圖2.8 中，可以看到芽枝孢子的特殊結(jié)構(gòu)：孢子不是平滑的，其頂端有芽。通過對(duì)比真菌青霉和芽枝孢子的結(jié)構(gòu)圖片，確定了這兩種真菌的屬類，F(xiàn)1 是青霉屬(Penicillium)，F(xiàn)2 是芽枝屬(Cladosporium)。

（二）降解石油烴的海洋真菌的降解能力分析

1.溫度。實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)定為16、22、28、34℃等4 個(gè)溫度梯度試驗(yàn)組，160r/min，pH7，石油含量為0.7%，振蕩培養(yǎng)7 天，同時(shí)不加菌液做對(duì)照，7 天后測(cè)定降解率，觀察得知，兩株菌在15～35℃范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng)，溫度對(duì)微生物石油降解能力的影響較大，具體表現(xiàn)為兩株菌的石油降解能力在一定范圍內(nèi)與溫度呈正向相關(guān)。二者石油降解能力隨著升高而提升，當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)到28℃時(shí)達(dá)到最大值，隨著溫度的繼續(xù)升高，它們的石油降解率均有所降低。溫度超過34℃時(shí)，兩株菌的石油降解率和生長(zhǎng)量均呈降低趨勢(shì)。因?yàn)?，微生物生長(zhǎng)代謝與溫度有關(guān)，當(dāng)溫度高于34℃時(shí)，菌株的酶活性逐漸降低。另外，石油烴對(duì)微生物細(xì)胞膜的毒性也逐漸加劇，限制了石油烴的降解。

2.石油濃度。實(shí)驗(yàn)選擇在石油含量為0.5%，0.7%，0.9%等3 個(gè)石油濃度梯度試驗(yàn)組，28℃，160r/min，pH7，振蕩培養(yǎng)7 天，同時(shí)不加菌液做對(duì)照，7 天后測(cè)定降解率，可以看出，兩株菌在0.5～0.9%濃度范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng)，石油濃度對(duì)微生物石油降解能力有較大影響，在石油濃度為0.7%時(shí)，微生物石油降解能力最大。因?yàn)?，作為該?shí)驗(yàn)中微生物生長(zhǎng)所需的唯一碳源，石油濃度過低時(shí)不能滿足大量微生物生長(zhǎng)代謝和繁殖的相關(guān)需求，會(huì)導(dǎo)致除油量減小。當(dāng)石油濃度增大到適于微生物生長(zhǎng)時(shí)，它們就會(huì)快速繁殖，繼而菌體數(shù)量增加，石油也被快速有效的分解利用，表現(xiàn)為除油量大幅度提高。而當(dāng)石油濃度過高時(shí)，會(huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生抑制作用，甚至殺死微生物細(xì)胞，對(duì)石油降解產(chǎn)生影響。

3.pH 值。實(shí)驗(yàn)設(shè)定了石油降解培養(yǎng)基的pH 值為4、5、6、7、8 等4 個(gè)不同pH值梯度試驗(yàn)組，石油含量為0.7%，28℃，160r/min，振蕩培養(yǎng)7 天，同時(shí)不加菌液做對(duì)照，7 天后測(cè)定降解率，可以看出，兩株菌在pH 值4～8 范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng)，pH 值對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖及其降解石油效率均產(chǎn)生了不同程度的影響，在pH 值為4-7這個(gè)范圍內(nèi)，降解率隨著pH 值增大而增大，當(dāng)pH 值為7 時(shí)，降解率上升至最大。當(dāng)pH 值大于7 時(shí)，微生物石油降解效率隨著pH 值上升而降低，說明堿性海水不適合這兩種菌株生長(zhǎng)。

4.菌液濃度。選擇菌液濃度為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%等6 個(gè)不同菌液濃度梯度試驗(yàn)組，pH 值為7，石油含量為0.7%，28℃，160r/min，振蕩培養(yǎng)7 天，同時(shí)不加菌液做對(duì)照，7 天后測(cè)定降解率，分析結(jié)果可知，石油降解率隨菌液濃度增加而升高，當(dāng)菌液濃度為2.5%時(shí)降解率達(dá)到最高，之后兩種真菌的降解率隨著菌液濃度提升而下降。由此可見，要利用微生物對(duì)石油進(jìn)行有效的降解，必須將菌液濃度控制在合理范圍內(nèi)。因?yàn)?，菌液濃度太小，菌體很難快速適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境，其生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，不利于石油降解；反之，則造成碳源短缺，菌體之間競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同樣不利于新生菌體的生長(zhǎng)，從而影響石油降解。

三、結(jié)論

1.從海洋動(dòng)植物體內(nèi)分離的微生物大多數(shù)具有降解石油烴的能力。2.分離出兩株真菌具有很好的降解石油烴的能力，分別為青霉屬(Penicillium)和芽枝屬(Cladosporium)，對(duì)石油烴的降解率達(dá)45%以上。3.從不同溫度、石油濃度、pH 值、菌液濃度4 個(gè)條件，探討和研究?jī)芍暾婢慕到庑Ч?，得出相?duì)優(yōu)化的條件，相關(guān)的探討有待進(jìn)一步深入研究。