小腦鋅指蛋白5與肝細胞癌臨床病理特征及預后的關系

楊麗，劉永橋，劉彬

(應城市人民醫(yī)院 1.病理科，2.肝膽外科，湖北 應城 432400)

肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，是全球第6大最常見的癌癥、第4大因癌致死的原因，嚴重威脅人的生命健康[1]。肝癌的發(fā)病機制目前尚未完全明確，闡明其機制并尋找潛在的分子生物學標志物將有助于改善患者的生存預后。小腦鋅指蛋白(zinc finger protein of the cerebellum，ZIC)家族包括ZIC1、ZIC2、ZIC3、ZIC4、ZIC5 5個成員，各自編碼鋅指轉錄因子，組成5個Cys2His鋅指結構域。ZIC家族在神經(jīng)、骨骼系統(tǒng)的發(fā)育中起到重要作用[2]。越來越多研究顯示，ZIC在多種疾病包括腫瘤[2- 3]發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其中ZIC5與腫瘤的關系最為密切。有研究顯示，ZIC5在前列腺癌、結直腸癌、肺癌和膠質瘤中高表達，并且參與其發(fā)生和發(fā)展[4- 6]。既往鮮有報道ZIC5在肝癌中的表達及其意義。本研究采用蛋白免疫印跡和免疫組化法檢測肝癌組織中ZIC5的表達，分析其與肝癌臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 標本

選取我院2010年1月至2013年1月手術切除的94例肝癌組織及其配對的癌旁組織標本?；颊呒{入標準：(1) 術前未接受過放化療；(2) 術后組織病理學檢查確診為肝癌；(3) 病歷資料完整?；颊吲懦龢藴剩?1) 隨訪資料不全；(2) 合并其他腫瘤。術后門診及電話方式對患者進行隨訪，隨訪截至2019年1月。手術切除的組織一部分用福爾馬林固定并石蠟包埋；另一部分凍存于-70 ℃冰箱。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準。

1.2 蛋白免疫印跡法檢測組織中ZIC5表達

隨機選取6例肝癌組織及其配對的癌旁組織進行檢測，取組織100 mg，充分研碎后加入組織裂解液(廣州捷倍斯生物科技有限公司)裂解20 min，隨后離心15 min，收集上清液。用BCA試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)檢測蛋白濃度。經(jīng)10%SDS- PAGE凝膠電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗(ZIC5單克隆抗體，1∶500)(美國Sigma公司)，4 ℃過夜后棄去一抗，TBST洗膜3次。隨后室溫孵育二抗，2 h后棄去二抗(艾美捷科技有限公司)，TBST洗膜3次。以GAPDH作為內(nèi)參，用ECL發(fā)光儀對蛋白進行成像，用Image J軟件分析灰度值。

1.3 免疫組化染色法檢測組織中ZIC5的表達水平

檢測所有癌組織和癌旁組織中ZIC5的表達。石蠟切片均由我院病理科制備，厚度為4 μm。檢測時常規(guī)脫蠟至水。將切片放置于檸檬酸鹽緩沖液(上海微蒙生物技術有限公司)中微波煮沸5 min，冷卻至室溫。滴加3%過氧化氫(上海微蒙生物技術有限公司)除去內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育10 min。隨后用山羊血清封閉10 min，滴加ZIC5單克隆抗體(美國Sigma公司)，4 ℃孵育過夜。滴加生物素標記的二抗(美國Sigma公司)。最后用DAB顯色、蘇木紫復染。經(jīng)脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀察。

根據(jù)細胞的染色強度及陽性細胞比例判斷ZIC5表達情況：(1) 陰性染色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；(2) 陽性細胞數(shù)為0～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，81%～100%計4分。將兩者計分相乘：0～3分為蛋白低表達(低表達組)；4～12分為蛋白高表達(高表達組)[7]。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較用配對t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較用卡方檢驗；生存分析采用Kaplan- Meier法；多因素分析采用COX比例風險回歸模型。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 蛋白免疫印跡法檢測組織中ZIC5表達水平

肝癌組織ZIC5相對表達量為0.86±0.13，明顯高于癌旁組織的0.25±0.08(t=9.789，P<0.001)，見圖1。

a 與肝癌組織相比，P<0.05

2.2 免疫組化染色法檢測組織中ZIC5的表達水平

ZIC5在癌旁組織中幾乎不表達，而在肝癌組織中高表達。ZIC5主要定位于細胞質，在細胞核中也有少量表達(圖2)。肝癌組織中ZIC5高表達59例(62.77%)，低表達35例(37.23%)。

圖2 免疫組化染色法檢測組織中ZIC5的表達水平 A.ZIC5在肝癌組織和癌旁組織中的表達情況(×100)； B.ZIC5在癌旁組織中幾乎不表達(×200)； C.ZIC5在肝癌組織中低表達(×200)； D.ZIC5在肝癌組織中高表達(×200)。NL為癌旁正常組織，HCC為肝癌組織

2.3 ZIC5與臨床病理特征的關系

ZIC5表達水平與肝癌分化程度、臨床分期、遠處轉移及肝硬化有關(均P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小、甲胎蛋白水平及HBsAg狀態(tài)無關(均P>0.05)，見表1。

表1 ZIC5表達與臨床病理特征的關系 例

2.4 ZIC5表達與肝癌患者生存預后的關系

Log- Rank檢驗結果顯示，高表達組總生存率和無瘤生存率均低于低表達組(均P<0.001)，見圖3。

圖3 ZIC5表達與肝癌患者生存預后的關系

2.5 肝癌患者生存預后的影響因素分析

COX多因素模型分析結果顯示，分化程度、臨床分期、遠處轉移和ZIC5高表達是肝癌患者總生存期和無瘤生存期的獨立影響因素(均P<0.05)，見表2和表3。

表2 肝癌患者總生存期的單因素和COX多因素分析

表3 肝癌患者無瘤生存期的單因素和COX多因素分析

3 討 論

肝癌是臨床上常見的腫瘤，雖然近年來肝癌的診治技術有了飛速發(fā)展，但是患者的5年生存率仍未見明顯提高，尤其是晚期肝癌患者[8]。尋找肝癌新型分子生物學標志并開發(fā)潛在的治療靶點有重要意義。為此，我們檢測了ZIC5在肝癌組織中的表達變化，并評估了其在臨床病理和預后預測中的作用。

ZIC5的分子質量大約68.4 kD，主要在神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)中發(fā)揮作用[2]。但是近年來大量研究顯示，ZIC5與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關[2]。有研究[4- 6]發(fā)現(xiàn)，ZIC5在前列腺癌、結直腸癌、肺癌和膠質瘤中高表達。但既往也有相反的研究結果，如Ma等[2]檢測了ZIC家族的5個成員，發(fā)現(xiàn)胃癌僅與ZIC1相關，而與ZIC5無關。Han等[9]發(fā)現(xiàn)，在浸潤性乳腺癌組織與正常組織中只有ZIC1表達具有差異，而ZIC5表達卻沒有差異，說明ZIC5的表達可能與組織特異性有關。本研究蛋白免疫印跡和免疫組化染色結果顯示，肝癌組織中ZIC5表達水平明顯高于癌旁組織，與Liu等[10]報道一致，提示ZIC5可能與肝癌的發(fā)生有關。此外本研究也發(fā)現(xiàn)，ZIC5高表達與腫瘤轉移、分化程度以及肝硬化有關。從分子機制分析：(1) ZIC5通過PDGFD基因介導FAK和STAT3的激活，進而促進腫瘤細胞增殖和侵襲[11]；(2) ZIC5通過Wnt- β- catentin信號通路促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷徙，進而影響患者的預后[10]；(3) ZIC5作為非編碼RNA的下游靶基因發(fā)揮作用[5,12]。

此外我們的研究結果還顯示，組織ZIC5高表達是影響肝癌預后的獨立危險因素，高表達組總生存率和無瘤生存率均低于低表達組。ZIC5在既往研究中就被證明與多種類型腫瘤如結腸癌[13]、肺癌[6]等患者的生存預后有關。本研究用COX多因素分析和生存曲線證實了ZIC5與肝癌患者預后的關系，ZIC5表達水平越高，肝癌患者總生存時間和無瘤生存時間越短，表明ZIC5可能具有成為肝癌預后標志物的潛力。

本研究存在一些局限性：(1) 未分析ZIC5與肝癌患者放化療敏感性的關系；(2) 樣本量相對較少；(3) 未檢測肝癌患者外周血ZIC5的表達，ZIC5對肝癌早期診斷的價值仍需未來進一步探討；(4) 未開展細胞或動物學研究探索ZIC5在肝癌中的具體作用機制。

綜上所述，肝癌組織中ZIC5表達水平明顯高于癌旁組織，ZIC5與肝癌分化程度、臨床分期、遠處轉移和肝硬化有關，ZIC5高表達可能預示患者總生存期和無瘤生存期較短。未來需要進一步探討ZIC5在肝癌中的作用機制。