艾滋病患者精液和血液中HIV釋放和序列差異的研究進展

陸珍珍，藍(lán)光華，張景云，林 玫

艾滋病是由HIV感染引起的免疫缺陷綜合征。近年來的研究報告顯示，全球新發(fā)艾滋病患者大多數(shù)通過性傳播途徑感染HIV所致[1]，男男性行為者（man who has sex with man, MSM）的感染數(shù)也迅猛增加[2]。精液傳播是MSM感染HIV的主要傳播途徑[3]，因此精液中HIV的特性與病毒傳播特征相關(guān)，但是精液與血液中HIV并不完全相同，本文從精液和血液中HIV的釋放、病毒序列差異、產(chǎn)生差異的機制這幾方面進行綜述。

1 HIV在精液和血液中的病毒釋放差異

“病毒釋放”指HIV載量在檢測限以上，即“病毒可測得到”。近年來較多研究報道，即使經(jīng)高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy, HAART）成功抑制了血液中HIV的感染者，其精液中仍然存在HIV釋放，但是這個“釋放”國際研究報道差異較大。在國外研究中，當(dāng)血液中HIV抑制到檢測不到的水平時，精液中HIV釋放率為1.8%～48.0%，HIV載量在80～16 026 copies/ml，大部分報道均＞200 copies/ml[4-6]。這些報道中HIV感染者精液中影響病毒釋放的因素也各不相同：合并性傳播疾病，如非淋菌性尿道炎、細(xì)菌感染[7-8]；生殖系統(tǒng)中較低的抗病毒藥物濃度[9-10]；血液中潛伏HIV DNA的濃度及吸毒[11]；合并巨細(xì)胞病毒感染[12]及異常的免疫T細(xì)胞激活狀態(tài)[13]，并且發(fā)現(xiàn)精液中的HIV有間斷釋放的規(guī)律[14]。

當(dāng)血液中HIV載量＜200 copies/ml，可以認(rèn)為HIV通過感染者傳給性伴侶的可能性極低或可忽略不計，即“undetectable=untransmited（U=U）[15]”。雖然在外周血中病毒載量降低的情況下，精液中的病毒載量也會降低，但仍存在部分患者的精液中病毒載量高于外周血，了解精液和血液HIV毒株不一致的機制對艾滋病的預(yù)防和治療都具有一定的意義。由于艾滋病治療的病毒學(xué)反應(yīng)與HIV毒株的亞型相關(guān)[16]，也與抗病毒治療用藥方案相關(guān)[10]，針對我國的藥物資源和病毒亞型，國內(nèi)也開展了一些這方面研究。

北京一項納入19例HIV感染的MSM的研究發(fā)現(xiàn)，HAART 6個月后，當(dāng)大部分（17/19）感染者血液中的HIV得到抑制時，還有大部分（16/19）患者的精液中可以檢測到HIV，病毒載量在306～60 500 copies/ml之間[17]。廣州的一項研究發(fā)現(xiàn)，20例外周血HIV得到抑制的男性HIV感染者中有2例精液中HIV仍可測到，病毒載量分別為47 copies/ml、221 copies/ml[18]。浙江研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)54例HIV感染者外周血中病毒抑制到檢測不到水平的時候，有3例精液中仍可以檢測到HIV，病毒載量為20.4～7470.0 copies/ml[19]。廣西一項納入48例有男男性行為的艾滋病患者的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HAART≥18個月，且在沒有合并其他性傳播疾病時，48例患者的精液與血液中均測不到HIV（病毒載量＜50 copies/ml）[20]。廣州、浙江和廣西進行的研究都發(fā)現(xiàn)這些成功進行HAART的艾滋病患者，治療后其精液中HIV釋放率不高，這與泰國的研究結(jié)果相一致[21]，而且絕大多數(shù)患者的病毒載量＜200 copies /ml，此種情況下可以認(rèn)為HIV通過性傳播途徑傳給陰性伴侶的幾率低[15]。

不同地區(qū)、不同研究中HIV在精液和血液中釋放的差異，可能與不同HIV亞型病毒學(xué)反應(yīng)[16]、抗病毒治療方案[22]、抗病毒時間長短[14]、不同種族[23]等有關(guān)，需要更多的研究加以證實。

2 精液和血液中HIV的序列差異

對來自世界不同地區(qū)共納入142例男性HIV感染者的13個獨立研究數(shù)據(jù)進行總結(jié)顯示，61.3%感染者的精液與血液中HIV毒株不同[24]。這些研究都是通過擴增HIV 膜區(qū)即env區(qū)的V1～V5段或env區(qū)全長進行精液和血液毒株的比較。Env區(qū)代表毒株的傳播能力，其中的CXCR4或CCR5輔助受體使用代表病毒的嗜性和致病能力，CXCR4嗜性的病毒致病性更強，但是env區(qū)變異程度較大。國內(nèi)報道HAART前不同HIV亞型對輔助受體CXCR4和CCR5的使用差異較大，HAART之后所有毒株均變成使用CCR5輔助受體，精液和血液中均測不到CXCR4的使用[20，25]。

對HIV序列穩(wěn)定的pol區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，血液中HIV毒株序列有無耐藥突變不能完全代表生殖道中HIV耐藥情況。美國2014年一項包含14個治療點的多中心研究納入的143例艾滋病患者血漿中HIV載量均＞2000 copies/ml，其中20%男性和24%女性患者的生殖道中HIV載量明顯高于血液中病毒載量，收集血漿和生殖道/唾液樣本進行核酸擴增，部分患者樣本擴增失敗，最后男性63例，女性83例獲得匹配樣本結(jié)果，分析發(fā)現(xiàn)：生殖道中和血液中HIV釋放不一致患者約占22%～24%，男性高于女性；約14%患者血液中HIV序列無耐藥突變但是生殖道中的HIV發(fā)生了耐藥突變，這種情況不僅發(fā)生在曾經(jīng)行HAART患者，也發(fā)生在未行HAART患者中，耐藥位點主要為D67N、K103N、184V。比較不同種類抗病毒藥物的耐藥率，兩個解剖學(xué)部位的標(biāo)本（血液、生殖道分泌物）HIV耐藥突變率的發(fā)生情況，分別為：核苷類77% vs. 68%、非核苷類36% vs. 36%，蛋白酶類32% vs. 27%[26]。與我國HIV藥物資源相近的泰國在2018年報道，從811例新發(fā)現(xiàn)HIV感染的MSM中篩選出7例存在基線基因型耐藥突變，比較血液、精液、肛門分泌物中HIV毒株的耐藥突變，發(fā)現(xiàn)只有3例血液和精液中HIV毒株突變情況一致；1例患者肛門分泌物中存在多重耐藥突變毒株，血液中卻沒有發(fā)生多重耐藥的情況，但是兩個部位的毒株突變位點均是CRF01_AE；另外3例肛門/精液中發(fā)生的耐藥突變位點與血液中不一致[27]。

3 精液和血液HIV毒株不一致的機制

精液由來自男性生殖器官和導(dǎo)管中產(chǎn)生的分泌物和細(xì)胞組成，在包括前列腺、睪丸、附睪、儲精囊、輸精管、尿道、龜頭在內(nèi)的外分泌器官和導(dǎo)管均可檢測到被HIV/猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）感染的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞[24]。

3.1 疾病進程相關(guān)性 在HIV感染急性期，感染者的精液具有很強的傳染性，表現(xiàn)為精液中高水平的HIV載量，白細(xì)胞中HIV DNA檢出率高，白細(xì)胞增多，炎癥與白細(xì)胞聚集有關(guān)的標(biāo)志物增多[28-29]。此時原發(fā)感染者精液中的HIV毒株在遺傳特征上與血液中毒株相似，表明這些毒株直接或近期從血液中輸入。對感染SIV的獼猴模型研究發(fā)現(xiàn)，SIV感染的白細(xì)胞數(shù)量（主要是T淋巴細(xì)胞）在感染2周內(nèi)比在感染慢性期時明顯增多[30-31]。這些被感染的細(xì)胞以新浸潤的白細(xì)胞作為代表，很可能作為記憶性T細(xì)胞成為HIV/SIV的早期靶細(xì)胞，在感染急性期的生殖道黏膜組織中大量浸潤、增殖。一直到感染11周，雄性獼猴的生殖道組織和血液中SIV毒株依然相似[32]。表明在感染早期，生殖道中HIV/SIV主要來源于血液中病毒的直接浸潤、擴散和轉(zhuǎn)入，此時精液和血液中病毒毒株是一致的。

HIV感染進入慢性期，精液和血液中病毒載量進入平臺期，研究顯示此時精液和血液中HIV載量和HIV基因型相關(guān)性低[33]。用單基因擴增技術(shù)在SIV感染獼猴模型中研究發(fā)現(xiàn)，從感染造模開始，在SIV感染2周內(nèi)，精液和血液中SIV毒株序列相似度高，此時差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但是到感染第十六周，體內(nèi)病毒載量進入平臺期，對HIV env區(qū)擴增進行進化樹分析顯示，此時精液和血液中SIV毒株之間序列的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）[34]。說明在HIV/SIV感染慢性期，精液中的毒株發(fā)生了局域化，生殖系統(tǒng)成為一個HIV潛伏池，局部生殖器官組織的HIV復(fù)制，是生殖道精液中病毒的重要來源。這種HIV在生殖系統(tǒng)中的“局域化”，在感染急性期之后進入平臺期即開始形成[35]。對造模感染SIV進入感染慢性期（感染后6～15個月）的亞洲獼猴模型的生殖器官解剖、SIV毒株序列分析，也發(fā)現(xiàn)這些組織器官中SIV與精液中SIV有遺傳相似性[36]，進一步支持了生殖系統(tǒng)中毒株的局域化論點。但是，對人體精液和血液中HIV毒株來源進行分析發(fā)現(xiàn)，精液中HIV來源具有多樣性和復(fù)雜性。Anderson等[37]對沒有接受HAART的HIV感染慢性期男性患者（其中C亞型12例，B亞型4例）進行精液和血液中病毒毒株分析。使用單基因擴增技術(shù)，從血漿和精漿中提取的病毒RNA生成cDNA作為病毒env基因單基因組擴增的模板，分析精漿和血漿中HIV毒株env區(qū)全長，以此推斷樣本中毒株的同源性。結(jié)果顯示：不同患者精液和血液中HIV毒株有不同的關(guān)系特征，有患者精-血毒株一致，沒有發(fā)現(xiàn)精液中局域化毒株的特征，稱為精-血毒株“平衡”；有患者精液中毒株來自血液毒株的“克隆”復(fù)制；也有患者出現(xiàn)精液中病毒的“局部復(fù)制”。HIV毒株演變?nèi)鐖D1所示。

圖1 血液和男性生殖道中HIV毒株演變[37]Figure 1 Evolution of HIV strains in blood and male reproductive tract[37]

3.2 藥物濃度相關(guān)性 HAART情況下，抗病毒藥物在精液和血液中的濃度差別較大：核苷類抗病毒藥物在精液中的濃度明顯高于血液中，如拉米夫定的精/血藥物濃度AUC為6.67（四分位距為4.10～9.14）；而非核苷類藥物在生殖道中濃度低于血液中；蛋白酶抑制劑在精液中濃度大約為血液中濃度的10%～20%[38]。國內(nèi)廣泛使用的一線藥物依非韋倫（efavirenz, EFV），在男性患者生殖道中的濃度僅為其血液中濃度的3%～10%[39-40]。精、血藥物濃度的差異主要是由于血-睪丸屏障的存在，這種屏障由支持細(xì)胞之間的緊密連接復(fù)合物組成，它限制了某些大分子進入生精小管的通道[41]。

事實證明，有效HAART啟動后，精液中HIV載量隨著血液中病毒載量下降而下降[42-43]，“治療即預(yù)防”是全球認(rèn)同的阻斷HIV經(jīng)性途徑傳播的有效方式[44-45]。然而，一些案例報道，血液病毒抑制的HIV陽性患者可通過性傳播途徑將HIV傳給陰性配偶[46-47]。一些研究探索精、血病毒的不一致與抗病毒藥物濃度差異的相關(guān)性。法國一項納入了33例血液病毒抑制艾滋病患者的多中心研究中，2例患者的精液中可檢測到病毒并且伴隨耐藥位點突變，其中1例是奈非那韋組合，精液和血液中病毒濃度比值為0.8∶1；另1例是洛匹那韋/利托那韋組合，精液和血液中濃度比值是0.07∶1[48]。Lorello等[49]發(fā)現(xiàn)在33例血液中HIV抑制（＜50 copies/ml）已經(jīng)超過1年以上的患者中有2例（6.1%）精液中HIV載量＞700 copies/ml，2例都沒有合并其他性病，都是服用含EFV組合，且EFV在精液中濃度不超過血液中的10%。這些研究都不同程度提示精、血抗HIV藥物濃度差異可能與與精、血病毒釋放、病毒序列不一致有關(guān)，但是也未能證明是精、血藥物濃度差異導(dǎo)致精、血病毒載量的不一致。另外有研究發(fā)現(xiàn)，盡管抗病毒藥物的精、血總濃度有差異，但是具有抗病毒活性的藥物濃度另有規(guī)律。如：核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類的三磷酸拉米夫定在精、血中濃度相當(dāng)，而三磷酸齊多夫定在精液中濃度為血液中的36%，三磷酸替諾福韋活化在精液中濃度比血液中高[50]。EFV雖然在精液中總濃度遠(yuǎn)低于血液中，但是游離狀態(tài)的EFV（被認(rèn)為有抗病毒治療作用的形式）在精、血中的濃度相當(dāng)[51]。值得提出的是，同一個抗病毒治療組合，不同個體之間藥物濃度的差異更為突出，這又涉及到不同個體轉(zhuǎn)運藥物的載體數(shù)量及活性、代謝酶的水平和多態(tài)性等多方面的因素[52]，是否這才是精、血藥物濃度與毒株變異差異的原因，須要更多研究進一步探索。

4 小 結(jié)

精液和血液中HIV釋放、HIV序列結(jié)構(gòu)不完全一致。由膀胱、睪丸、附睪、儲精囊、前列腺、陰莖、尿道、龜頭這些生殖道器官組成的生殖系統(tǒng)形成特殊的“黏膜屏障”，導(dǎo)致精液和血液中HIV毒株存在不一致的解剖結(jié)構(gòu)。黏膜組織是一個特殊的動態(tài)微環(huán)境，疾病進程、局部免疫壓力、藥物滲透性不同、個體的代謝差異等均可能是HIV毒株在局部生殖系統(tǒng)發(fā)生變異的生理病理基礎(chǔ)。