重癥手足口病患兒T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子水平變化

岳 瑾，馮曉靖，黃振紅，王 芳

手足口病是由EV感染所致的一種傳染性疾病，在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是全球性公共衛(wèi)生問題之一。該病常見于嬰幼兒，大多數(shù)患者癥狀較輕，表現(xiàn)為口腔、手、足等部位出現(xiàn)斑丘疹、皰疹，可伴有發(fā)熱，預(yù)后良好[1]。個(gè)別患者可發(fā)展為重癥，常累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)生心肌炎、急性遲緩性癱瘓、無菌腦膜炎、腦干腦炎等疾病，甚至引起死亡。已知自然界中有20多種EV可導(dǎo)致手足口病，其中Cox A組和B組、埃可病毒、EV 71型最為常見，由于該病病原學(xué)組成持續(xù)變化，流行毒株也在改變，因此持續(xù)監(jiān)測病原感染趨勢十分必要[2-3]。研究表明，分析患者免疫系統(tǒng)指標(biāo)、血清炎癥細(xì)胞因子水平，有助于判斷患者機(jī)體免疫狀況、病情進(jìn)展等[4-5]。為此，本研究對我院收治的手足口病患兒的外周血T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子水平變化進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 將2018年1月—2020年4月在鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院治療的97例手足口病患兒納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合原中國衛(wèi)生部發(fā)布的《手足口病診療指南（2013年版）》[6]（指南）中手足口病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡1～12歲；③在我院采用相同治療方案；④家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)[7-8]：①合并其他感染；②6個(gè)月內(nèi)患有其他傳染?。虎?個(gè)月內(nèi)發(fā)生呼吸道感染；④患有其他EV感染性疾??；⑤合并內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)疾病。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

參照指南[6]中疾病嚴(yán)重程度的判定標(biāo)準(zhǔn)，將患兒分為重癥組（25例）和輕癥組（72例）。重癥組中男13例，女12例，平均（3.97±0.29）歲；輕癥組中男39例，女33例，平均（4.02±0.31）歲。納入同期50例健康體檢兒童為對照組，其中男27例，女23例，平均（3.94±0.23）歲。3組間上述資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

根據(jù)感染病毒種類不同，將重癥組患兒分為：Cox A16組（13例）、EV 71組（8例）、其他組（4例）。Cox A16組男7例，女6例，平均（3.93±0.54）歲；EV 71組，男4例，女4例，平均（3.99±0.38）歲；其他組，男2例，女2例，平均（4.01±0.21）歲；3組間上述資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

根據(jù)指南[6]將重癥組患兒分為急性期組（6例）和恢復(fù)期組（19例）。急性期組男3例，女3例，平均（4.01±0.22）歲；恢復(fù)期組男10例，女9例，平均（3.89±0.27）歲；2組間上述資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

根據(jù)不同預(yù)后結(jié)局，將重癥組患兒分為預(yù)后不良組（5例）和預(yù)后良好組（20例）。預(yù)后不良組男3例，女2例，平均（3.95±0.49）歲；預(yù)后良好組男10例，女10例，平均（3.99±0.21）歲；2組間上述資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 NK細(xì)胞檢測 患兒入院 24 h內(nèi)抽取2 ml肘靜脈全血，置于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，取100 μl抗凝處理后的全血垂直加入計(jì)數(shù)管底部，分別加CD56、CD45、CD16、CD3四色熒光標(biāo)記抗體，均為20 μl，混勻后在室溫避光孵育15 min，向其中加500 μl溶血素，震蕩混合均勻后在室溫下避光孵育10～15 min，每管均加PBS 500 μl，震蕩混合均勻并上機(jī)檢測。以CD45+、CD3-設(shè)門，以CD56為縱坐標(biāo)，CD16為橫坐標(biāo)，檢測NK細(xì)胞即CD3-CD16+CD56+百分率。T淋巴細(xì)胞亞群檢測：另取100 μl抗凝處理的全血，垂直加至計(jì)數(shù)管底，加CD8、CD4、CD3三色熒光標(biāo)記抗體，均為 20 μl，混合均勻后在室溫條件下避光孵育15 min，加500 μl溶血素混合均勻，繼續(xù)室溫避光孵育10～15 min，每管加PBS 500 μl，混勻上機(jī)檢測，CD3+和光散射設(shè)門，CD8為縱坐標(biāo)，CD4為橫坐標(biāo)，檢測CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞百分率。

1.2.2 T淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子檢測 使用美國BD公司提供的FACS Calibur流式細(xì)胞儀；Simulset軟件分析結(jié)果；使用美國BD公司生產(chǎn)的CD8+PE、CD4+FITC和CD3+PerCP三色抗體和CD（16+56）抗體。使用酶聯(lián)免疫法檢測外周血TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平，均按試劑盒（南京奧尼多福公司）說明書進(jìn)行。免疫學(xué)指標(biāo)和細(xì)胞因子檢測由同一組檢驗(yàn)科醫(yī)師完成操作。

1.3 觀察指標(biāo) 對比T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞）、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子（TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17）水平在對照組、輕癥組、重癥組間的差異，在重癥組不同類型病毒感染組（Cox A16組、EV 71組、其他組）間的差異，以及重癥組中急性期組與恢復(fù)期組間的差異，預(yù)后不良組和預(yù)后良好組間的差異。

1.4 療效評(píng)估 體溫正常，精神良好，無肢體抖動(dòng)、皮疹，皰疹結(jié)痂無液體滲出為顯效；體溫＜37.5 ℃，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀好轉(zhuǎn)，無驚跳、嘔吐發(fā)生，大部分皰疹干燥結(jié)痂，少數(shù)有液體滲出為好轉(zhuǎn)；以上均為預(yù)后良好。皰疹、體溫、精神狀態(tài)無明顯改善或死亡，均為預(yù)后不良。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P=0.05（雙側(cè)）為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性界值。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，3組間比較采用F檢驗(yàn)，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。經(jīng)ROC曲線檢測4項(xiàng)細(xì)胞因子預(yù)測不良預(yù)后效能。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對照組、輕癥組、重癥組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子水平對比 CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞水平從高到低均依次為對照組、輕癥組、重癥組；CD8+T細(xì)胞水平從低到高依次為對照組、輕癥組、重癥組，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。血清TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平從低到高均依次為對照組、輕癥組、重癥組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 對照組、輕癥組、重癥組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較Table 1 Comparison of T lymphocyte subsets, NK cells and cytokines levels in control group, mild group and severe group

2.2 不同類型病毒感染組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平對比 Cox A16組、EV 71組、其他組之間T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 不同類型病毒感染組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較Table 2 Comparison of T lymphocyte subsets, NK cells and cytokines levels in different infection type groups

2.3 急性期組與恢復(fù)期組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較 與恢復(fù)期組相比，急性期組患兒CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞水平更低，CD8+T細(xì)胞、TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平更高，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 急性期組與恢復(fù)期組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較Table 3 Comparison of T lymphocyte subsets, NK cells and cytokines levels between acute phase group and recovery phase group

2.4 不同預(yù)后組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較 與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞水平更低，CD8+T細(xì)胞、TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平更高，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表4。

表4 不同預(yù)后組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較Table 4 Comparison of T lymphocyte subsets, NK cells and cytokines levels in different prognosis outcomes

2.5 細(xì)胞因子預(yù)測預(yù)后不良ROC分析 4項(xiàng)細(xì)胞因子聯(lián)合預(yù)測患兒不良預(yù)后敏感度為83.33%，準(zhǔn)確度為71.43%。見表5。

表5 細(xì)胞因子預(yù)測不良預(yù)后ROC分析Table 5 ROC analysis of cytokines in predicting poor prognosis

3 討 論

T淋巴細(xì)胞具有誘導(dǎo)或輔助免疫應(yīng)答、抑制免疫應(yīng)答及殺傷靶細(xì)胞功能，介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫，并將細(xì)胞中病原體清除。CD3+T細(xì)胞是外周血成熟T細(xì)胞的最佳標(biāo)志物之一，可用于免疫缺陷、T淋巴細(xì)胞型淋巴瘤、白血病等分析[10]。CD4+T細(xì)胞作為人體免疫系統(tǒng)指揮中樞，負(fù)責(zé)控制和消滅多種感染，對抗入侵病菌，常用于白血病、淋巴瘤的免疫分型診斷，能評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能和免疫抑制療法效果[11]。CD8+T細(xì)胞是抑制性和殺傷性T淋巴細(xì)胞以及遲發(fā)超敏反應(yīng)T細(xì)胞的共同標(biāo)記，對某些腫瘤細(xì)胞、病毒等抗原物質(zhì)有殺傷作用，是機(jī)體抗腫瘤、抗病毒免疫防線的重要組成[12]。本研究中，輕癥組和重癥組患兒外周血CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平均較對照組低，重癥組患兒較輕癥組更低；3組CD8+T細(xì)胞水平比較，對照組最低，其次為輕癥組，重癥組最高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。既往研究指出重癥手足口病患兒外周血CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平顯著下降[13]，與本研究結(jié)果基本一致。

CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞分化形成抗體，可控制和消滅多種感染，對抗病菌入侵，阻止疾病發(fā)作和加重；CD8+T細(xì)胞抑制抗體合成和分泌；CD4/CD8比值互相制約，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，但CD4/CD8比值失衡提示免疫功能紊亂，CD4+T細(xì)胞降低而CD8+T細(xì)胞升高提示機(jī)體抗病免疫力不足。相對于健康兒童，手足口病患兒細(xì)胞免疫功能受損，機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞水平大幅下降，CD8+T細(xì)胞水平升高。上述指標(biāo)在重癥組與輕癥組、預(yù)后良好組和預(yù)后不良組間比較，輕癥組患兒機(jī)體細(xì)胞免疫功能受損較輕，機(jī)體免疫功能關(guān)系預(yù)后，但機(jī)體免疫紊亂嚴(yán)重時(shí)往往提示患兒抗凝能力差，提示預(yù)后不良，故重癥組和預(yù)后不良組患兒均呈現(xiàn)更顯著的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平下降和CD8+T細(xì)胞水平升高。與急性期組相比，恢復(fù)期組患兒細(xì)胞免疫功能正在逐漸恢復(fù)，機(jī)體免疫應(yīng)激狀態(tài)逐漸解除，因此CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平較急性期更高，CD8+T細(xì)胞水平較急性期更低。上述研究結(jié)果說明病情更重、預(yù)后不佳的患兒細(xì)胞免疫功能紊亂越明顯；考慮手足口病主要病原體為EV 71型和Cox A16型，EV感染導(dǎo)致患兒腸道微生物群生態(tài)失調(diào)和丁酸鹽生成細(xì)菌減少，致病菌增多，損傷腸道生物黏膜屏障及住宿免疫，導(dǎo)致免疫功能紊亂；此外，患兒機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，促進(jìn)疾病恢復(fù)同時(shí)導(dǎo)致免疫損傷。

NK細(xì)胞是重要免疫細(xì)胞，是天然免疫系統(tǒng)核心細(xì)胞，分布在肝臟、外周血、脾臟中，負(fù)責(zé)殺傷受病毒感染的細(xì)胞、老化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等異常細(xì)胞[14-15]。本研究中NK細(xì)胞水平從高到低依次為對照組、輕癥組、重癥組；重癥患兒中急性期組NK細(xì)胞較恢復(fù)期組低；預(yù)后不良組NK水平較預(yù)后良好組低（P均＜0.05）。提示NK細(xì)胞低水平患兒病情重、預(yù)后差?？紤]是因?yàn)镹K細(xì)胞能繞過TCR/CD3識(shí)別途徑，以主要組織相容性復(fù)合體非限制形式快速識(shí)別并殺滅侵入人體的病毒，同時(shí)分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，上調(diào)吞噬細(xì)胞吞噬功能，從而阻止病情進(jìn)展，改善預(yù)后。

TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17 是反映機(jī)體炎性狀態(tài)，指導(dǎo)病情評(píng)估和治療的重要指標(biāo)[16]。手足口病為感染性疾病，發(fā)病后機(jī)體會(huì)釋放大量致炎因子，導(dǎo)致血 TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平升高[17-18]。故本研究中輕癥組上述指標(biāo)均高于對照組，重癥組高于輕癥組（P均＜0.05）。病情重，急性期和預(yù)后不良的患兒往往機(jī)體炎癥反應(yīng)更顯著，輕癥患兒炎癥反應(yīng)較輕，因此以手、足、口等紅暈和皰疹為特征，免疫功能紊亂較輕，免疫指標(biāo)異常較輕，預(yù)后良好；重癥患兒炎癥反應(yīng)強(qiáng)，細(xì)胞免疫功能失衡較重，因此T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、炎癥相關(guān)細(xì)胞因子異常更明顯，表現(xiàn)為腦膜炎、心肌炎等癥狀，預(yù)后相對較差[19-20]。這也是預(yù)后不良組TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平更高（P＜0.05）的重要原因。但上述單項(xiàng)細(xì)胞因子指標(biāo)用于預(yù)測患兒不良預(yù)后，敏感度和準(zhǔn)確度低，意義不大。本研究中ROC曲線分析顯示，4項(xiàng)細(xì)胞因子聯(lián)合預(yù)測患兒不良預(yù)后的敏感度為83.33%，準(zhǔn)確度為71.43%，提示聯(lián)合應(yīng)用可提高預(yù)測患兒不良預(yù)后的效能。

綜上所述，重癥手足口病患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子水平顯著異常，患兒存在免疫紊亂、明顯炎癥反應(yīng)，檢測上述指標(biāo)利于病情和預(yù)后判斷，指導(dǎo)診斷治療；此外上述檢查方便快捷，創(chuàng)傷性小，短期可重復(fù)性強(qiáng)；但單獨(dú)使用其中一種指標(biāo)敏感度、準(zhǔn)確性低，須要聯(lián)合上述各項(xiàng)指標(biāo)以及其他方法進(jìn)行觀察。