乙型肝炎病毒血清學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用CLIA和ELISA的作用及檢出率分析

程 實(shí) 劉利芹

（福建省莆田市荔城區(qū)醫(yī)院，福建 莆田 351144）

乙型肝炎為當(dāng)下臨床高發(fā)性病毒性肝炎，病理機(jī)制是機(jī)體遭受乙型病毒感染，隨病情發(fā)展可致肝硬化、肝癌等嚴(yán)重并發(fā)癥形成，危及患者生命安全，需盡早診斷、及時(shí)診療[1]。實(shí)踐指出，人體免疫體系遭受乙型肝炎病毒感染后表現(xiàn)出特異性免疫效應(yīng)，其血清學(xué)指標(biāo)呈較大改變，因而對(duì)乙型肝炎病毒血清學(xué)指標(biāo)展開(kāi)測(cè)定有助于早期評(píng)定乙型肝炎，同時(shí)做好預(yù)后評(píng)估。CLIA（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法）均為檢測(cè)方法，其中ELISA檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且成本較低，但亦具局限性，難以做到精確定量分析[2]。CLIA不但具有較高的檢測(cè)敏感度，且能夠迅速完成定量分析，因而在臨床得到廣泛運(yùn)用，尤其是在乙型肝炎病毒相關(guān)性血清標(biāo)志物測(cè)定中效果顯著。本研究取2018年1月至2020年1月86例疑似病例展開(kāi)研究，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年1月于本院就診的疑似乙型肝炎病毒患者研究，統(tǒng)計(jì)86例。視實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)所得結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分別采用CLIA、ELISA就血清學(xué)標(biāo)志物（表面抗原、e抗原、e抗體及核心抗原、表面抗體）展開(kāi)測(cè)定。納入病例男50例，女36例，年齡最大值、最小值分別為75歲、24歲，平均年齡為（49.51±7.26）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)患者同意，并簽訂知情書(shū)；無(wú)溝通障礙；伴惡心嘔吐、全身乏力及肝區(qū)疼痛等表現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝腎肺器質(zhì)性病變；凝血功能障礙；罹患精神疾??；檢查禁忌證。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑的選擇 選擇ELISA400全自動(dòng)螺旋發(fā)光酶免一體機(jī)，儀器自身含有酶標(biāo)儀；由安圖生物工程提供CLIA試劑盒，由北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司提供ELISA試劑盒。

1.2.2 檢測(cè)方法 將實(shí)時(shí)熒光定量PCR所檢驗(yàn)結(jié)果視作乙型肝炎診斷金標(biāo)準(zhǔn)，具體方法：選取100 μL血清標(biāo)本及試劑盒對(duì)照品，實(shí)施離心處理（1 000 r/min），時(shí)間10 min，取其上清液，然后置于血清標(biāo)本100 μL震蕩搖勻后，再次實(shí)施離心操作，時(shí)間為10 min，轉(zhuǎn)速1 000 r/min，棄上清液，在沉淀物中置于血清標(biāo)本（25 μL），震蕩混勻，沸水浴10 min后離心，取上清液。取PCR反應(yīng)液37.6 μL，將其放置于離心管中，而后添入Taq酶與尿苷酶（0.06 μL），視作反應(yīng)管，添加處理標(biāo)本與對(duì)照品各2 mL，設(shè)定對(duì)照品濃度梯度，混勻后送至待檢區(qū)，采取核酸擴(kuò)增儀完成PCR擴(kuò)增。

CLIA：基于機(jī)體空腹?fàn)顟B(tài)下抽取其5 mL外周靜脈血，離心10 min，分離血清備檢。備檢血清標(biāo)本需置于聚苯乙烯試管，采取50 μL辣根過(guò)氧化酶予以標(biāo)記，而后置于37 ℃環(huán)境下，1 h后采取磷酸鹽緩沖液實(shí)施沖洗，3min/次，沖洗6次。完成以上步驟后，在室溫下添加氫氧化鈉（0.1 mol/L，100 μL），靜置10 min，然后添加過(guò)氧化氫（50 μL，3%），測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，如若e抗原臨界數(shù)值超過(guò)1.00，視作陽(yáng)性。

ELISA：將濃縮洗滌液使用蒸餾水亦或是去離子水20倍稀釋；按順序進(jìn)行樣品對(duì)應(yīng)微孔板的編號(hào)，不同板應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照3孔，陽(yáng)性對(duì)照2孔及空白對(duì)照孔，對(duì)于雙波長(zhǎng)測(cè)定，不設(shè)空白對(duì)照孔；除空白孔外，各孔均置入20 μL樣品稀釋液，分別于對(duì)應(yīng)孔中放置待測(cè)樣品亦或是陰陽(yáng)性對(duì)照100 μL，緩慢振蕩混勻；以封板膜將微孔板實(shí)施封閉，置于（37±1）℃環(huán)境下溫育，時(shí)間1 h左右。而后再在每孔中添加酶標(biāo)識(shí)劑（50 μL），輕輕振蕩混勻，再次封板置于（37±1）℃環(huán)境下溫育，時(shí)間半小時(shí)左右。揭掉開(kāi)封板膜，采取洗板機(jī)洗滌，至少5遍，最后1遍盡可能扣干，最后加入顯色劑A、B液，均為50 μL，振蕩混勻，基于（37±1）℃避光環(huán)境下顯色半小時(shí)，加入終止液（50 μL），10 min內(nèi)測(cè)定結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) ①實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果。②CLIA、ELISA測(cè)定結(jié)果。③統(tǒng)計(jì)CLIA、ELISA檢測(cè)于血清學(xué)標(biāo)志物中的測(cè)定結(jié)果，如表面抗原、e抗原、e抗體及核心抗原、表面抗體。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 借助SPSS22.0軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)展開(kāi)處理分析，計(jì)量資料用（）表示，以t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，以χ2檢驗(yàn)，P＜0.05存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，86疑似病例中，乙型肝炎達(dá)到52例，檢出率60.47%，其中表面抗原、e抗原、e抗體及核心抗原、表面抗體陽(yáng)性檢出例數(shù)分別為8例、10例、15例、9例、10例，34例為乙型肝炎病毒感染，但其DNA為陰性。

2.2 CLIA與ELISA測(cè)定結(jié)果 結(jié)果顯示，CLIA真陽(yáng)性、真陰性比為49∶29；ELISA真陽(yáng)性、真陰性比為40∶32。見(jiàn)表1。

表1 CLIA與ELISA測(cè)定結(jié)果比較（n）

2.3 CLIA與ELISA診斷效能 相比于ELISA檢測(cè)，CLIA陰性預(yù)測(cè)值、敏感度及準(zhǔn)確度明顯較高，對(duì)比P＜0.05；兩組陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及特異度比較P＞0.05。見(jiàn)表2。

表2 CLIA與ELISA診斷效能比較（%）

2.4 CLIA、ELISA檢測(cè)于血清學(xué)標(biāo)志物中的測(cè)定結(jié)果 結(jié)果顯示，CLIA于血清學(xué)標(biāo)志物中檢出率[94.23%（49/52）]相比于ELISA[69.23%（36/52）]明顯更高（χ2=10.883，P=0.001）。

3 討 論

乙型肝炎為高發(fā)性病毒性肝炎，患病率較高，且極易反復(fù)發(fā)作。研究表示，乙型肝炎患病早期癥狀無(wú)典型性特征，導(dǎo)致漏診、誤診風(fēng)險(xiǎn)增加，進(jìn)而使疾病惡化，危及患者生命安全，因而找尋有效、安全的早期診斷方法尤為重要[3]。乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物測(cè)定為當(dāng)下臨床鑒別、診斷乙型肝炎的重要方法，傳統(tǒng)標(biāo)志物測(cè)定多由ELISA完成，該檢測(cè)方法具簡(jiǎn)單、快速及價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，在乙肝疾病診斷、診療中具一定作用，同時(shí)此方法于定性分析中具較好的效果，但在定量分析檢測(cè)中效果欠佳，因標(biāo)本測(cè)定物濃度偶有濃度升高表現(xiàn)，導(dǎo)致鉤狀效應(yīng)形成，對(duì)測(cè)定結(jié)果精準(zhǔn)性產(chǎn)生影響。ELISA測(cè)定原理為借助酶顯色原理完成測(cè)定，測(cè)定精密度相對(duì)較低，當(dāng)抗原亦或是抗體與酶聯(lián)結(jié)合物濃度處于較低水平時(shí)，其吸光度較低，極易出現(xiàn)假陰性的問(wèn)題，所以，ELISA測(cè)定方法全面性不足，推廣受限。隨醫(yī)學(xué)事業(yè)發(fā)展及進(jìn)步，ELISA已無(wú)法滿足現(xiàn)階段對(duì)乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)及診斷，基于此背景下，CLIA相應(yīng)而生[4]。CLIA工作原理在于利用發(fā)光底物具備的發(fā)光強(qiáng)度特征對(duì)標(biāo)志物實(shí)施測(cè)定，具較高的敏感度，可進(jìn)行體內(nèi)血清標(biāo)志物實(shí)際狀況的直觀了解，備受臨床青睞[5]。

本次研究取2018年1月至2020年1月疑似病例實(shí)施研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于ELISA，CLIA檢測(cè)精準(zhǔn)性、陰性預(yù)測(cè)值及敏感度明顯提高，組間對(duì)比P＜0.05，兩組特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較P＞0.05；CLIA于血清學(xué)標(biāo)志物檢出率較ELISA高，組間對(duì)比P＜0.05，提示CLIA較ELISA有著更高的檢出率，可精準(zhǔn)檢出低濃度表面抗原，直觀反映出HBV受染進(jìn)程，為后期臨床制定診療方案奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[6]。不僅如此，CLIA于診療效果評(píng)價(jià)方面、測(cè)定HBV復(fù)制方面均具重大意義，考慮是CLIA在測(cè)定過(guò)程中借助科學(xué)性能較高全自動(dòng)儀器及相應(yīng)的試劑對(duì)血清標(biāo)志物展開(kāi)測(cè)定，從一定程度上避免了外在因素的感染，確保其測(cè)定穩(wěn)定性。ELISA易遭受手工加樣等因素影響，使標(biāo)志物顏色深淺發(fā)生變化，從而影響結(jié)果精準(zhǔn)性。因測(cè)定方法局限性，使表面抗原測(cè)定物易呈現(xiàn)出假陰性狀態(tài)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CLIA利用順磁性微粒固相載體，其反應(yīng)面積較大，能夠反復(fù)多次利用標(biāo)志物，將發(fā)光時(shí)間延長(zhǎng)，從而增強(qiáng)反光強(qiáng)度，進(jìn)而對(duì)HBV受染進(jìn)程清晰反映，保證CLIA測(cè)定穩(wěn)定性[7-9]。焦陽(yáng)[10]研究中，CLIA于表面抗原、e抗原、e抗體等標(biāo)志物中檢出率較ELISA高，提示CLIA可動(dòng)態(tài)化測(cè)定乙型肝炎病情的進(jìn)展?fàn)顩r，與本次研究中，CLIA于血清標(biāo)志物檢出率94.23%（49/52）高于ELISA69.23%（36/52）近似一致，證實(shí)本研究真實(shí)可行。但限于納入樣本數(shù)量較少，關(guān)于CLIA檢測(cè)的遠(yuǎn)期效果還需進(jìn)一步論證。

綜上所述，乙型肝炎病毒血清學(xué)檢驗(yàn)中采取CLIA（化學(xué)發(fā)光法）具較高的檢出率，可輔助臨床制訂診療方案，并為預(yù)后評(píng)估提供有力依據(jù)，屬理想、可行性較高的診斷方法，值得推廣及進(jìn)一步運(yùn)用。