宮內(nèi)慢性缺氧對成年雄性大鼠心肌細(xì)胞eNOS表達(dá)及磷酸化的影響

王圣楠 李雅雅 陳幼芳 * 杜心清

（1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建 泉州 362000；2 廈門市兒童醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，福建 廈門 361000；3 泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)院，福建 泉州 362000）

有前沿學(xué)者曾調(diào)研過流行病學(xué)特征，不健康子宮內(nèi)環(huán)境對胎兒期的影響會導(dǎo)致兒童期易患疾病外，還會增加成人時期感染非傳染性疾病的風(fēng)險[1]。如果胎兒持續(xù)暴露于不利的宮內(nèi)環(huán)境，包括氧氣和營養(yǎng)因素，會使生理系統(tǒng)復(fù)位，導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量和表觀遺傳的改變，從而導(dǎo)致成年后心血管疾病[2-3]。作為一氧化氮合酶的亞型之一，eNOS在引起心血管疾病的同時，若eNOS表達(dá)下降或生物活性下降，可引起血管內(nèi)皮功能障礙[4]。磷酸化調(diào)控會干擾eNOS的活性在轉(zhuǎn)錄、翻譯階段，尤其是絲氨酸1177位點(diǎn)（Ser1177）和蘇氨酸495位點(diǎn)（Thr495）2個位點(diǎn)[5]。本研究在前人基礎(chǔ)上，通過研究eNOS分子活性修飾途徑即磷酸化的改變，以期探索面對宮內(nèi)缺氧時eNOS活性改變的相應(yīng)分子機(jī)制及成人疾病編程的研究。

1 材料與方法

1.1 缺氧模型建立與分組 由上海斯萊克實驗動物公司提供清潔級SD雌性孕鼠12只，孕齡7 d，通過隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為缺氧組與對照組（各n=6）。建立宮內(nèi)慢性缺氧模型，6只孕鼠置于缺氧艙內(nèi)，每日8 h持續(xù)缺氧，箱內(nèi)氧濃度為（10.0±0.5）%。常氧對照組的6只孕鼠也置于相同的玻璃箱內(nèi)，持續(xù)通入空氣[6]。

1.2 動物標(biāo)本采集 按隨機(jī)數(shù)字表法在生產(chǎn)后于每窩剛生產(chǎn)后的大鼠里選取1只雄性，經(jīng)過11個月的飼養(yǎng)，到實驗結(jié)束時，對照組有6只存活，缺氧組有5只存活。將動物麻醉之后迅速取出心臟，僅保留室間隔及左心室，固定于10%的甲醛溶液，脫水、包埋室溫備用，余標(biāo)本液氮中速凍后轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱備檢。

1.3 Western Blot法測定eNOS、eNOS（Thr495）、eNOS（ser1177）表達(dá) 配置試劑后組織切塊加入裂解液，待充分裂解后進(jìn)行離心取上清，用考馬斯亮藍(lán)法測定各細(xì)胞樣本蛋白含量，進(jìn)行蛋白樣品變性、電泳，封閉1 h后用一抗用封閉液稀釋（內(nèi)參抗體稀釋度為1∶1 000），洗膜后將一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中，用image J軟件分析灰度值（抗體及試劑盒分別由美國Zymed Laboratories公司、江蘇厚普生物公司提供）。

1.4 統(tǒng)計方法 使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：計量資料用（）描述，行t檢驗。當(dāng)P＜0.05時，表示存在統(tǒng)計學(xué)差別。

2 結(jié)果

Western Blot法測定eNOS、Ser1177、Thr495表達(dá)結(jié)果以Western Blot依次檢測eNOS、Thr495、Ser1177表達(dá)（圖1）。可見Thr495位點(diǎn)磷酸化程度有所升高而Ser1177位點(diǎn)磷酸化程度有所降低（圖2）。

圖1 Western Blot法檢測eNOS、Thr495、Ser1177表達(dá)

圖2 Western Blot法測定eNOS、Ser1177、Thr495表達(dá)結(jié)果

3 討 論

目前認(rèn)為宮內(nèi)慢性缺氧通常以變動eNOS及其分子伴侶，如CAV-1、HSP90、血清內(nèi)皮素-1、CAM的表達(dá)，從而導(dǎo)致成人發(fā)生心血管疾病[7-8]。作為調(diào)控eNOS活性的重要途徑之一，宮內(nèi)慢性缺氧過程中的eNOS磷酸化尚未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)慢性缺氧將導(dǎo)致雄性成年期出現(xiàn)eNOS蛋白表達(dá)下降，故提示宮內(nèi)慢性缺氧對機(jī)體作用時間長，效果顯著，eNOS表達(dá)降低后會減少NO生成，心血管系統(tǒng)沒有NO的保護(hù)作用，會從胎兒期一直持續(xù)到中年，這可能是控制成人慢性宮內(nèi)缺氧所致心血管疾病發(fā)生的機(jī)制[9-10]。

eNOS在翻譯后修飾階段有著復(fù)雜的模式，蛋白激酶與蛋白磷酸酶傳導(dǎo)的去磷酸化及磷酸化網(wǎng)絡(luò)充當(dāng)對eNOS活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的重要翻譯后修飾[11-12]。磷酸化程度則直接影響eNOS與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合力[13-14]。一方面蛋白激酶-B、蛋白激酶-A和鈣調(diào)蛋白都能在Ser1177位點(diǎn)磷酸化eNOS，從而增強(qiáng)eNOS與鈣調(diào)素的結(jié)合。另一方面，此外，蛋白激酶-A和蛋白激酶-C通道傳導(dǎo)THR495位點(diǎn)的eNOS磷酸化受到抑制，影響其和CaM結(jié)合在一起。細(xì)胞受刺激之后往往引發(fā)Thr495迅速去磷酸化，以推動CaM與eNOS結(jié)合生成NO。故eNOS活性與Ser1177和Thr495互相之間的磷酸化/去磷酸化程度相關(guān)。

綜上所述，慢性宮內(nèi)缺氧可顯著下調(diào)成年雄性大鼠心肌細(xì)胞eNOS蛋白和eNOS Ser1177的表達(dá)，上調(diào)成年雄性大鼠心肌細(xì)胞eNOS Thr495的表達(dá)。