不同加工方法對豬源性肉類基因組DNA提取效果影響的比較研究

魏曉雅 陳健 李婷婷 劉德星 岳巧云

(中山海關技術中心 廣東中山 528403)

1 前言

動物源性食品與人類生產生活息息相關，是民生的重要消費品。各國政府都針對動物源性食品安全監(jiān)管制定了嚴厲的政策法規(guī)，但仍有少數不法分子在利益驅動下，通過各種手段進行摻雜造假，如2013年席卷歐洲的“馬肉事件”、明星火鍋店“牛血冒充鴨血”事件、“淡水虹鱒魚冒充三文魚”事件等，給食品安全的監(jiān)管工作帶來巨大挑戰(zhàn)，也對動物源性食品的種類鑒別工作提出更高的要求，尤其是對深加工食品的成分準確和快速鑒定方法提出了迫切需求。

在深加工食品的加工過程中，切割、攪拌，食品添加劑、防腐劑，高溫高壓等處理都會改變原材料的形態(tài)、味道和口感，這導致深加工食品原材料的物種鑒別變得非常困難。目前國內外對深加工食品物種鑒別的常見方法有：顯微觀察法、光譜分析法、質譜分析法、免疫分析法、電泳分析法等，這些方法因假陽性率高、性價比低、特異性差、靈敏度低等不能廣泛應用，隨著現代分子生物學檢測技術的發(fā)展，DNA條形碼技術在深加工食品的物種鑒定工作中具有更廣闊的的前景[1]。

DNA條形碼(DNA barcoding)是利用生物本身所具有的一段或幾段易擴增的、標準的、有足夠變異的、相對較短的DNA片段來進行物種鑒定的技術[2]，DNA條形碼技術不受動物源性加工食品原始可識別形態(tài)特征的限制，技術標準化，目前已廣泛應用于動物源性加工食品類物種鑒定，如陳健[3]利用DNA條形碼技術檢測36份調理肉制品的成分，發(fā)現其中29份樣品成分與標識成分不符；Quinto[4]利用DNA條形碼技術測定54份美國境內零售商出售的野生動物肉制品成分，發(fā)現18.5%的野生動物肉制品存在虛假標簽的問題；石盼盼[5]利用DNA條形碼技術發(fā)現河南省范圍內大型超市牛肉產品摻雜豬肉和雞肉的情況比較嚴重。

在動物源性加工食品的加工過程中，不僅改變了原材料的外觀，導致檢測人員無法利用形態(tài)、味道和色澤等外觀特征進行種類判斷，還有可能造成原材料核酸成分的降解，從而導致分子檢測結果的不理想。因此，本文探索不同加工方式(腌制、高壓、炸、燒、炒、蒸、燉煮)處理的豬肉樣品對基因組DNA提取效果的影響，通過對比分析進行確認，并在此基礎上優(yōu)化PCR反應體系，實現加工食品中動物源性成分的鑒定，以期為食品安全監(jiān)管提供技術支持，保證廣大消費者的利益。

2 材料與制備

2.1 實驗材料

新鮮豬肉樣品、調味料均購自本地超市。

2.2 加工方法

2.2.1 不同腌制方式

對新鮮豬肉樣品切薄片后均勻分成9份，1份為對照，不添加任何調味料腌制，在4℃條件下放置24 h；8份為實驗組，其中4份用調味料(食鹽、醬油、食鹽加醬油、混合調料)在4℃條件下腌制24 h[6]，調味料的用量為樣品重量的1%[7]；另外4份用對應的調味料(食鹽、醬油、食鹽加醬油、混合調料)在4℃腌制24 h，調味料的用量為樣品重量的10%。

2.2.2 高壓

將不同調味料腌制的樣品和對照樣品分別置于干凈的容器中，在高壓滅菌鍋中，121℃處理20 min，取出晾涼備用。

2.2.3 不同烹飪方式

不同調味料腌制的樣品和對照樣品分別進行以下處理：經炸、燉、炒、蒸、燉煮烹飪至熟透(按照家庭常用烹飪方法操作)，具體方法如下：

(1)炸：在鍋中加入適量且等量的油，油燒熱后，將樣品分別放入鍋中炸熟，待樣品在油鍋中浮起后取出晾涼備用。

(2)燒：熱鍋中放入適量且等量的油，樣品分別放入炒制變色后，加入適量且等量的水，大火煮沸，小火至湯汁收干，取出晾涼備用。

(3)炒：在鍋中加入適量且等量的油，樣品分別放入鍋中炒熟，取出晾涼備用。

(4)蒸：蒸鍋中倒入開水，樣品分別放入蒸鍋中，蒸熟，取出晾涼備用。

(5)燉煮：在鍋中加入適量且等量的水燒開后，將樣品分別放入鍋中，充分燉熟，取出晾涼備用。

2.2.4 不同燉煮時間

在鍋中加入適量且等量的水燒開后，將不同調味料腌制的樣品和對照樣品，分別放入鍋中，分別燉煮0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后依次撈出，晾涼備用。

3 試劑與儀器

Ex Taq酶、dNTP、10×buffer、瓊脂糖、6×Loading buffer及引物(寶生物工程(大連)有限公司)；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(目錄號DP304-03)及DNA markerII(天根生物科技有限公司)；SYBR Green I(廣州普博欣科技有限公司)；50×TAE(索萊寶生物科技有限公司)。

GR60DR高壓滅菌鍋(美國ZEALWAY公司)；PIC017微量臺式離心機(美國HERAEUS公司)；PCMT恒溫金屬浴(英國Grant公司)；ABI Proflex三槽PCR儀(美國ABI公司)；DYY-6C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；D-55-26M-AUTO凝膠成像儀(美國UVP公司)。

4 試驗方法

4.1 DNA提取

處理完畢的樣品及對照樣品，每份各取30 mg放入1個1.5 ml離心管中備用，不對樣品進行任何脫油脫鹽的處理，直接按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書指導提取基因組DNA。

4.2 PCR反應體系的優(yōu)化

4.2.1 引物對PCR反應結果的影響

本研究共選用5對多細胞脊椎動物DNA條形碼的通用引物，先使用不同烹飪方式處理過的樣品，探索出適用性較佳的引物，優(yōu)先使用擴增長度為658 bp/702 bp的引物對樣品DNA進行擴增，擴增不出后再選用擴增長度為244 bp/376 bp/472 bp的引物對樣品DNA進行擴增。引物信息詳見表1[8-10]。

表1 引物信息表

4.2.2 退火溫度對PCR反應結果的影響

使用未經任何方式處理過的樣品，采用溫度梯度PCR反應，每隔2°設置溫度梯度。溫度范圍設定為：42～68℃。

PCR反應體系(50μl)：10×buffer 5μl；正向引物(20 nmol/μl)1μl；反向引物(20 nmol/μl)1μl；dNTP(10 nmol/μl)2μl；EX-Taq(5 U/μl)0.5μl；模板DNA(60 ng/μl)1μl；無菌水定容至50μl[11]。

Ex-Taq DNA聚合酶擴增條件：94℃變性5min；94℃、30s；42-68℃、30s；72℃、10min；30個 循 環(huán)；72℃延伸10min。

PCR擴增完成后，經1%瓊脂糖進行電泳分離后，使用凝膠成像系統分析擴增產物。

4.3 測序

成功擴增的PCR產物送至廣州天一輝遠科技有限公司進行測序。測序引物同擴增引物。

5 結果與分析

5.1 引物適用性

先使用不同加工方式(腌制、炸、燒、炒、蒸、燉煮)處理過的樣品，用引物LCO1490/HCO2198以及BatL5310/R6036R，退火溫度參照參考文獻[11]使用50℃，對所有樣品進行擴增，擴增結果(圖1)表明，對不同加工方式處理過的樣品，引物BatL5310/R6036R的適用性明顯優(yōu)于LCO1490/HCO2198。

5.2 退火溫度

使用未經任何方式處理過的樣品，探索PCR的最適退火溫度，每隔2°設置溫度梯度，溫度范圍設定為：42～68℃。PCR擴增結果(圖2)顯示退火溫度的上限在68℃左右后，從62℃(11泳道)起，未出現雜帶，將在不同退火溫度梯度下擴增的PCR產物全部送測序，獲得的序列完全一致。綜合考慮擴增引物的適用性和擴增效率使用62℃退火溫度對不同加工方式處理的樣品的DNA進行擴增，PCR擴增結果見圖3。

5.3 加工方式

由圖3和4可知，不同濃度的調味料腌制的樣品對擴增效果并無影響，不同烹飪方式(炸、燒、炒、蒸)處理過的樣品對擴增效果也無影響，但隨著燉煮時間的增長，對擴增效果會有影響，當燉煮時間達到1.5 h時，條帶亮度明顯減弱；當燉煮時間達到2 h時，當使用引物BatL5310/R6036R只有部分樣品有擴增條帶，但全部樣品均可用短片段引物(244 bp/376 bp/472 bp的片段)擴增出(圖5)。

經高壓處理過的樣品都不能擴增出658 bp/702 bp大小的片段，但能全部擴增出244 bp大小的片段，部分樣品能擴增出376/472 bp的片段(圖6)，說明經高壓處理的樣品，DNA受到了一定程度的破壞，不易擴增出大片段的基因。

5.4 應用

隨機購買8種加工動物源性食品，應用上述方法對購買的樣品進行物種鑒定，將PCR檢測結果為陽性的樣品送至廣州天一輝遠科技有限公司進行測序，測序結果與GenBank中的序列進行比對，PCR檢測及DNA條形碼鑒定結果見表2，說明該方法不僅適用于市售加工豬肉類食品的物種鑒定，也可以應用于其他種類動物源性加工食品成分份的檢測。

表2 加工動物源性食品的PCR檢測及DNA條形碼鑒定結果

6 討論

本文探索了不同加工方式對豬肉基因組DNA提取的影響，并對PCR反應體系進行優(yōu)化，通過對樣品DNA的PCR擴增產物進行測序即可鑒別物種來源。結果表明，一般的常見加工方式(腌制、炸、燒、炒、蒸、燉煮)對擴增效果并無影響，而隨著烹飪時間或者溫度壓強的增加，DNA受到了一定程度的破壞，對擴增效果則有影響。試驗結果與黃婭琳[12]、Arslan[13]等研究結果一致，可用擴增短片段的引物進行擴增。豬肉樣品的檢測，引物用BatL5310/R6036R，退火溫度選擇62℃，擴增效果良好。相比現有相同技術的物種鑒定方法，本方法操作便捷、所需儀器設備簡單、檢測成本低，適用于對市售常見加工豬肉類樣品物種鑒定，亦可推廣應用于其他肉類樣品的檢測，在應用此方法對其他肉類樣品進行物種鑒定過程中發(fā)現，煙熏的加工方式對長片段的擴增可能會有影響，將在后續(xù)的研究中進一步探討。