微衛(wèi)星狀態(tài)與結直腸癌臨床病理特征、外周血T細胞及基因突變的關系

鐘國方，張 航，袁 霞 （惠州市中心人民醫(yī)院腫瘤內科，廣東惠州 516000）

結直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率近年來呈上升趨勢，嚴重危害人類的健康[1]。研究表明，微衛(wèi)星(MS)狀態(tài)與結直腸癌的發(fā)展、預后、療效、遺傳等均有相關[2-4]。所有結直腸癌患者均被推薦完善微衛(wèi)星狀態(tài)檢測[5]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制復雜，影響因素眾多，基因突變在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，并一定程度上影響著患者的預后[6]。T 淋巴細胞亞群是人體內主要的細胞免疫系統(tǒng)，是影響結直腸癌患者預后的危險因素[7]，但外周血T 淋巴細胞亞群與微衛(wèi)星狀態(tài)的關系尚不清楚。本文通過分析微衛(wèi)星狀態(tài)與結直腸癌的臨床病理特征、外周血T 細胞及基因突變的關系，以期為結直腸癌患者的診治提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2017 年11 月至2020 年11 月在惠州市中心人民醫(yī)院診斷為結直腸癌并完善衛(wèi)星狀態(tài)、外周血T淋巴細胞或基因檢測患者180 例，經(jīng)病理確診為腺癌，TNM分期為Ⅱ～Ⅳ期，排除其他部位惡性腫瘤。

1.2 方法

微衛(wèi)星狀態(tài)采用多重熒光PCR 毛細管電泳法檢測，該方法是微衛(wèi)星狀態(tài)檢測的金標準，靈敏度高，特異性強。檢測位點包括6 個單核苷酸重復標志物（NR21、NR24、NR27、BAT25、BAT26 和MONO27）。結果出現(xiàn)2 個或以上的不穩(wěn)定為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定(MSI-H)，存在1 個位點為微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（MSIL），而無不穩(wěn)定位點則為微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)[8]?；蛲蛔儾捎酶咄繙y序方法進行檢測，標本類型為石蠟切片或全血，同時檢測腫瘤相關突變熱點區(qū)域的單堿基替換突變和插入缺失突變。采用多重PCR 技術靶向捕獲，一次實驗同時對92 個擴增子進行高通量測序，目標區(qū)域的平均覆蓋度不低于1 000倍，檢測靈敏度的下限為1%。外周血T 淋巴細胞亞群檢測基于抗原抗體特異性反應原理，將人體外周血中表達有CD抗原的細胞固定于單克隆抗體包被玻片上，通過淋洗、染色等操作后，對特異性細胞進行自動計數(shù)儀自動計數(shù)。Semibio CD系列細胞檢測玻片，將特異性抗體事先包被在芯片基板上，樣本中表達有該特異性抗原細胞與芯片接觸反應后，特異性細胞被分離固定，再通過自動計數(shù)儀對固定細胞分析。外周血T 淋巴細胞亞群檢測選用化療前的檢測結果。結合患者的臨床資料及相關檢查結果，根據(jù)微衛(wèi)星狀態(tài)劃分為MSI-H 和MSS/MSI-L 患者，分析不同微衛(wèi)星狀態(tài)與臨床病理特征、外周血T 淋巴細胞水平及基因突變間的關系。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料以頻數(shù)或%表示，采用χ2檢驗。外周血T 淋巴細胞根據(jù)受試者工作特征曲線（ROC）判斷界值。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基線特征

納入180 例患者中男105 例，女75 例；年齡29～87歲，平均（57.15±11.60）歲；直腸癌64例（35.6%），結腸癌116 例（64.4%），其中左半結腸癌為75 例（64.7%），右半結腸癌為41 例（35.3%）；分化類型（檢測缺失7 例）：高分化1 例（0.6%），中分化134 例（77.4%），低分化38 例（22.0%）；TNM 分期：Ⅲ期占42.2%，Ⅱ期占36.7%，Ⅳ期占21.1%；153 例完成腫瘤化療前外周血T 細胞檢測，CD3+、CD4+、CD8+平均值均處于正常參考值范圍；180 例完成微衛(wèi)星狀態(tài)檢測，MSI-H 患者19 例（10.6%），MSS/MSI-L 患者161例（89.4%）；159 例完成基因突變狀態(tài)檢測，KRAS 突變率最高，有76 例發(fā)生突變，其余分別為PIK3CA（15.0%）、TP53（8.3%）、NRAS（4.4%）、BRAF（3.3%）、ERBB2（2.2%）、EGFR（2.2%）、AKT1（1.7%）、MET（1.1%）。

2.2 結直腸癌患者臨床病理特征與微衛(wèi)星狀態(tài)的關系

MSI-H 患者＜60 歲的比例為89.5%，高于MSS/MSI-L 患者的56.5%（P＜0.01）。在結直腸癌中，MSIH 患者腫瘤發(fā)病部位在結腸的比例較MSS/MSI-L 患者更高，分別為89.5%和61.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而在結腸癌中，MSI-H 患者更常見于右半結腸（64.7%，11/17），而MSS/MSI-L 患者更常見于左半結腸（69.7%，69/99），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

180 例患者中，173 例有明確的分化類型，7 例無法鑒定分化類型。MSI-H 與MSS/MSI-L 患者均以中高分化居多，但MSI-H患者低分化型的比例明顯高于MSS/MSI-L 患者（47.4%vs18.8%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 結直腸癌患者臨床病理特征與微衛(wèi)星狀態(tài)的關系（例）

2.3 結直腸癌患者外周血T 細胞計數(shù)與微衛(wèi)星狀態(tài)的關系

180 例患者中153 例行腫瘤化療前外周血T 細胞檢測（MSS/MSI-L137 例，MSI-H 16 例）。根據(jù)ROC曲線及AUC 算得CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的最佳界值分別為1 372、766、438 和1.17。MSI-H 患者CD3+≥1 372 個/μL、CD4+≥766 個/μL、CD8+≥438 個/μL的比例明顯高于MSS/MSI-L 患者（P＜0.05 或0.01），而兩組的CD4+/CD8+差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 結直腸癌患者外周血T細胞計數(shù)與微衛(wèi)星狀態(tài)的關系

2.4 結直腸癌患者的基因突變狀態(tài)與微衛(wèi)星狀態(tài)的關系

180 例患者中159 例行基因突變狀態(tài)檢測（MSS/MSI-L 142 例，MSI-H 17 例）。MSI-H患者發(fā)生PIK3CA 突變的比例明顯高于MSS/MSI-L 患者（P＜0.05）。KRAS 突變76 例，突變率最高，但MSI-H 與MSS/MSI-L 患者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 結直腸癌患者的基因突變狀態(tài)與微衛(wèi)星狀態(tài)的關系 （例）

3 討論

據(jù)調查，結直腸癌在全球惡性腫瘤發(fā)病中位居第3 位，雖然中國人群的發(fā)病率低于西方國家，但近30年來亦呈現(xiàn)快速增長趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星狀態(tài)與結直腸癌的發(fā)展、預后、療效、遺傳等相關，且具有較為特殊的臨床病理特征[2-4]。在微衛(wèi)星狀態(tài)的檢測中，MSI-H 比例為7%～15%[5,9]。結腸癌中的MSI 表型是良好的預后因素，在Ⅱ期患者中表現(xiàn)更為明顯。這種存活優(yōu)勢似與MSI腫瘤浸潤淋巴細胞有關，提示可能存在更有效的抗腫瘤免疫反應[10]。本研究中MSI-H比例為10.6%，與上述文獻報道相似。在與臨床病理特征的關系分析中發(fā)現(xiàn)，MSI-H 結直腸癌患者的年齡＜60歲比例顯著高于MSS/MSI-L患者，且其發(fā)病部位多集中在右半結腸，而MSS/MSI-L 患者則以左半結腸為主。造成此差異的原因可能是由于患者DNA 錯配修復狀態(tài)不足。右半結腸癌通常為黏液性，被腫瘤浸潤性淋巴細胞密集浸潤，并具有激活的MAPK 信號，可能由癌前病變發(fā)展而來。癌前病變是由與細胞特異性相關的通路驅動的，如對DNA 修復缺陷和致癌應激的耐受性通路[11]。而微衛(wèi)星不穩(wěn)定正是由DNA 錯配修復系統(tǒng)缺陷引起的[12]。因此MSI-H 可能參與了右半結腸癌的發(fā)生過程。在分化程度方面，MSI-H 患者在低分化的比例較MSS/MSI-L 患者明顯升高。在TNM 分期上，MSI-H 患者的分期更早，國內外研究證實了此結論[13-14]，但在本研究中差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能與病例樣本量不大有關。

細胞免疫與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，而T 淋巴細胞亞群是人體內細胞免疫最主要的執(zhí)行者。CD3+T 細胞的數(shù)量代表了機體總的細胞免疫狀態(tài)；CD4+T 細胞是輔助性T 細胞，參與細胞因子的分泌，輔助其他免疫細胞從而起到調節(jié)免疫平衡作用；CD8+T細胞是抑制性/細胞毒性T細胞，在抗癌免疫中起著核心作用；CD4+/CD8+比值的動態(tài)平衡對維持機體細胞免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定起到重要作用，當CD4+/CD8+比值降低，則患者的免疫功能降低，有利于腫瘤的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H 患者的CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+T 水平均高于MSS/MSI-L 患者，其中CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或0.01）。MSI-H 患者CD3+、CD4+、CD8+細胞相比MSS/MSI-L 患者明顯升高，提示MSI-H 患者的免疫功能相對更活躍。有研究發(fā)現(xiàn)，與MSS 相比，MSIH 結直腸癌患者具有更高的腫瘤浸潤免疫細胞組成，MSI-H 患者輔助性T細胞明顯升高，CD8+T細胞和活化記憶CD4+T 細胞有升高的趨勢[15]，這與本研究外周血T 細胞亞群分布存在一定的相似性。Chirica等[14]發(fā)現(xiàn)，相對于MSS 患者，從MSI-H 患者腫瘤浸潤淋巴細胞中分離出的CD4+T細胞的百分比顯著降低，CD8+T細胞的百分比則顯著升高。而CD8+T細胞的浸潤部分是由MSI 引起的[16]。腫瘤浸潤淋巴細胞與外周血T 細胞可能存在一定的差異性，仍需更多的研究，并可進一步探究其與微衛(wèi)星狀態(tài)的關系。近年來有研究通過免疫評分評估腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)，但需要通過腫瘤浸潤淋巴細胞進行評估。而外周血T細胞亞群檢測更方便，并可反復進行多次檢測。因此如何更好地應用外周血T 細胞水平反映腫瘤免疫微環(huán)境及指導臨床的診治是我們今后研究的方向。

不同微衛(wèi)星狀態(tài)的基因突變比例存在一定差異，本研究中，MSI-H 結直腸癌患者PIK3CA 突變率顯著高于MSS/MSI-L 患者（P＜0.05）。PIK3CA 是結直腸癌中最常見的突變基因之一，在外顯子9和20的解旋酶和激酶結構域中分別約80%的突變熱點。研究發(fā)現(xiàn)，MSI 與外顯子9 突變呈負相關，與外顯子20 突變呈正相關[17]，但PIK3CA 突變與結直腸癌患者的生存無顯著相關[18]。結腸癌中的MSI 表型是良好的預后因素，PIK3CA 基因在MSI 患者中突變比例升高能否影響患者的預后仍需進一步探討。本研究中KRAS突變率最高，但MSI-H 與MSS/MSI-L 患者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。BRAF V600E 突變是MSIH 轉移性結直腸癌患者的不良預后因素[4]。對于Ⅲ期且行術后輔助化療的結腸癌患者，BRAF 或KRAS 突變與MSS 患者的預后相關，其復發(fā)與生存時間更短[19]。但在本研究中，BRAF V600E 突變MSI-H 與MSS/MSI-L 患者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與Lin等[20]研究不一致，或與本研究樣本量較少有關。

綜述所述，結直腸癌患者不同微衛(wèi)星狀態(tài)的臨床病理特征、外周血T 淋巴細胞亞群、基因突變狀態(tài)都存在一定的差異性。這些差異性對不同微衛(wèi)星狀態(tài)患者的預后可能存在一定的影響。MSI-H 患者治療前的外周血T細胞水平相對MSS/MSI-L患者更高，對于治療后T 細胞水平的變化情況仍需進一步追蹤。同時，應用外周血T 細胞水平反映腫瘤免疫微環(huán)境及指導臨床的診治、療效與預后判斷仍需進一步研究。