柴胡皂苷A減輕腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元損傷

馬大亮， 崔紅莉， 榮衛(wèi)江， 賈琦， 黃福獻(xiàn)

1.新疆維吾爾自治區(qū)第三人民醫(yī)院腦病中心，烏魯木齊 830000； 2.新疆心腦血管病醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊 830000 3.新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院建工醫(yī)院神經(jīng)外科，烏魯木齊 830000

腦血管疾病是危害老年人健康的常見疾病，具有發(fā)病率高，致殘率高，死亡率高的特點(diǎn)[1]。腦缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷是缺血區(qū)域的血

流再灌注導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損傷和相關(guān)功能障礙[2]。近年來(lái)，中藥對(duì)腦缺血再灌注損傷的防治受到重視。柴胡皂苷A（Saikosaponin A，SA）是一種從藥用植物柴胡中提取的三萜皂苷，具有抗炎和抗氧化作用[3]。據(jù)報(bào)道，在體外，柴胡皂苷A能抑制LPS誘導(dǎo)的原代小鼠巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生[4]，能抑制LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥和氧化應(yīng)激[5]。在體內(nèi)，柴胡皂苷A可通過抑制NF-κB活化來(lái)預(yù)防實(shí)驗(yàn)性敗血癥[6]，還可保護(hù)小鼠免受葡聚糖硫酸鈉誘發(fā)的結(jié)腸炎[7]。然而，目前尚未見報(bào)道柴胡皂苷A對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。腦缺血引起的腦組織損傷的病理機(jī)制很復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡等[8]。沉默信息調(diào)節(jié)器1（silent information regulator 1，SIRT1）是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，是能量代謝和基因穩(wěn)定的關(guān)鍵基因，也是缺血性腦血管病的潛在治療靶點(diǎn)[9]。本研究主要探討柴胡皂苷A對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元損傷和氧化應(yīng)激、SIRT1水平的影響，期為防治缺血性腦血管疾病的臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 柴胡皂苷A（HPLC＞98%，批號(hào)：20180213；規(guī)格：1 g）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；尼莫地平（HPLC＞98%，批號(hào)：20170826；規(guī)格：50 mg）購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒（批號(hào)：20180521）購(gòu)自美國(guó)PIERCE公司；MatrigelTM底膜基質(zhì)（批號(hào)：20170816）購(gòu)自美國(guó)BD公司；Caspase3抗體（批號(hào)：20180219），Caspase9抗體（批號(hào)：20180313），Bax抗體（批號(hào)：20170427），Bcl-2抗體（批號(hào)：20170506），SIRT1抗體（批號(hào)：20170422）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠二抗（批號(hào)：20180602）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；大鼠CKMb ELISA試劑盒（批號(hào)：20180608），Mb ELISA試劑盒（批號(hào)：20181011）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；SOD試劑盒（批號(hào)：20170229）、MDA試劑盒（批號(hào)：20170512）、LDH試劑盒（批號(hào)：20170324）購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；OLYMPUSDP71顯微鏡（日本奧林巴斯光學(xué)有限公司）；高速低溫離心機(jī)（Beckman公司，美國(guó)）；電泳槽，電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP（美國(guó)UVP公司）。

1.1.3 動(dòng)物 選用54只SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠，鼠齡8個(gè)月，體重240～280 g，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2016-0001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 隨機(jī)分為6組，每組9只大鼠，分別為假手術(shù)組（Sham）；模型組（I/R，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)建立腦缺血再灌注模型）；柴胡皂苷A 1 mg/kg組（I/R+SA 1 mg/kg）；柴胡皂苷A 5 mg/kg組（I/R+SA 5 mg/kg）；柴胡皂苷A 10 mg/kg（I/R+SA 10 mg/kg）；尼莫地平1 mg/kg組（I/R+NMDP 1 mg/kg）。建模成功后分別用1、5、10 mg/kg的柴胡皂苷A或1 mg/kg尼莫地平灌胃給藥，每日給藥1次，給藥容積是1 ml，連續(xù)給藥7 d。假手術(shù)組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.2.2 腦缺血再灌注模型構(gòu)建方法 將大鼠仰臥位固定，腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）用微動(dòng)脈夾夾閉10 min，松開10 min，再夾閉10 min復(fù)制大鼠腦缺血再灌注模型[10]。

1.2.3 腦損傷指標(biāo)檢測(cè) 記錄各組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)犯錯(cuò)次數(shù)，Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)新異臂進(jìn)入次數(shù)；然后處死大鼠，取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干后稱濕重，置于培養(yǎng)皿中，濾紙吸干表面水分，入烘箱90℃烘干后取出，經(jīng)多次稱量直至恒重后記錄，作為組織干重。計(jì)算腦含水率及腦指數(shù)。

腦含水率（%）＝（濕重-干重）/濕重×100%；腦指數(shù)＝腦濕重/體重×100

1.2.4 HE染色觀察腦組織病理?yè)p傷 取部分腦組織放入4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，24 h后脫水，石蠟包埋、切片；然后HE染色：將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ、100%、95%、90%、80%、70%的酒精各10 min，自來(lái)水沖洗；蘇木精染色、伊紅染色；由低到高濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；光學(xué)顯微鏡拍照，觀察其形態(tài)特征。

1.2.5 尼氏小體染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 取部分腦組織放入4%多聚甲醛溶液固定30 min，將標(biāo)本移至30%蔗糖溶液約72 h，OCT膠進(jìn)行包埋，再進(jìn)行冰凍切片。將腦片置于尼氏液中室溫下染色10 min；75%、95%、100%酒精各脫色1 min，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片；顯微鏡下觀察照相。

1.2.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白和SIRT1的表達(dá) 取適量腦組織勻漿，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，1：3加入，勻漿，12000 r·min-1離心10 min，取上清，根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書測(cè)蛋白濃度。勻漿上清液與上樣緩沖液1：1配比，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗，ECL發(fā)光劑顯影，采用BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Image J2x軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 試劑盒檢測(cè)腦組織氧化應(yīng)激水平 取適量腦組織勻漿，分別采用SOD，MDA，LDH試劑盒測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的水平。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用軟件SPSS 21.0對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s）表示。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)及Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)犯錯(cuò)次數(shù)顯著增加（P<0.05）；新異臂進(jìn)入次數(shù)顯著減少（P<0.05）。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)犯錯(cuò)次數(shù)顯著減少（P<0.05）；新異臂進(jìn)入次數(shù)顯著增加（P<0.05）。

圖1 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)犯錯(cuò)次數(shù)（A）和Y迷宮實(shí)驗(yàn)新異臂進(jìn)入次數(shù)（B）統(tǒng)計(jì)圖*P<0.05，與假手術(shù)組相比#P<0.05，與I/R組相比n＝9Fig.1 Statistical chart of the number of errors made in the step-down test(A) and number of new arm entries(B)*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs I/Rgroup;n=9

2.2 HE染色結(jié)果

如圖2所示，假手術(shù)組海馬區(qū)域組織染色均勻、結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常；模型組海馬區(qū)域結(jié)構(gòu)紊亂、間質(zhì)水腫、胞核出現(xiàn)深染、固縮、碎裂。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組海馬區(qū)神經(jīng)元病變范圍變小，程度減輕。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死率，腦含水率和腦指數(shù)均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組大鼠腦梗死率，腦含水率和腦指數(shù)均顯著降低（P<0.05）。

圖2 HE染色觀察腦組織病理?yè)p傷（A）及腦梗死率（B）、腦指數(shù)（C）、腦含水量（D）統(tǒng)計(jì)圖*P<0.05，與假手術(shù)組相比 #P<0.05，與I/R組相比n＝9Fig.2 Statistical chart of pathological damage of brain tissue(A),cerebral infarction rate(B),brain index(C),brain water content(D),detected by HEstaining*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs I/Rgroup;n=9

2.3 柴胡皂苷A對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

如圖3所示，尼氏小體染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬區(qū)域組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常；腦損傷模型組海馬區(qū)域結(jié)構(gòu)紊亂、神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞核碎裂、溶解及尼氏小體崩解及丟失。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組海馬區(qū)神經(jīng)元損傷程度減輕。免疫印跡結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組Bax/Bcl-2、Cleaved caspase3/caspase3 和 Cleaved caspase9/caspase9的比值均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組Bax/Bcl-2、Cleaved caspase3/caspase3和Cleaved caspase9/caspase9的比值顯著降低（P<0.05）。

圖3 柴胡皂苷A對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡的影響A：尼氏小體染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡B：蛋白印跡檢測(cè)Bax/Bcl-2、Cleaved caspase3/caspase3和Cleaved caspase9/caspase9表達(dá)水平*P<0.05，與假手術(shù)組相比#P<0.05，與I/R組相比n＝9Fig.3 Effect of different concentrationsof saikosaponin A on neuronal apoptosisin ratswith cerebral ischemia-reperfusion A:The neuron apoptosis was detected by Nissl body staining;B:The expression levels of Bax/Bcl-2,Cleared caspase3/caspase3 and Cleared caspase9/caspase9 weredetected by Western blotting;*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs I/Rgroup;n=9

2.4 柴胡皂苷A對(duì)腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激的影響

如圖4所示，與假手術(shù)組比較，模型組SOD活性顯著降低（P<0.05）；MDA和LDH的含量均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組10 mg/kg組SOD活性顯著升高（P<0.05），MDA和LDH的含量均顯著降低（P<0.05）。

圖4 柴胡皂苷A對(duì)腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激的影響A：SOD活性統(tǒng)計(jì)圖B：MDA含量統(tǒng)計(jì)圖C：LDH含量統(tǒng)計(jì)圖 *P<0.05，與假手術(shù)組相比#P<0.05，與I/R組相比n＝9Fig.4 Effects of different concentrations of saikosaponin A on oxidative stress in rats with cerebral ischemiareperfusion A:Statistical chart of SOD activity;B:Statistical chart of MDA content;C:Statistical chart of LDH content;*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs I/Rgroup;n=9

2.5 柴胡皂苷A對(duì)SIRT1表達(dá)的影響

如圖5所示，與假手術(shù)組比較，模型組SIRT1 mRNA表達(dá)和SIRT1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組SIRT1 mRNA表達(dá)和SIRT1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。

圖5 柴胡皂苷A對(duì)SIRT1表達(dá)的影響A：RT-qPCR檢測(cè)SIRT1 mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖B：蛋白印跡檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá)*P<0.05，與假手術(shù)組相比#P<0.05，與I/R組相比n＝9Fig.5 Effect of different concentrations of saikosaponin A on the expression of SIRT1 A:Statistical chart of SIRT1 mRNA expression detected by RT-qPCR;B:SIRT1 protein expression detected by Western blot;*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs I/Rgroup;n=9

3 討論

由腦缺血引起的腦組織損傷的病理機(jī)制很復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡，能量代謝，鈣超載和其他因素[11]。缺血區(qū)域的血流再灌注會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損傷和相關(guān)功能障礙，尤其是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損傷[12]。柴胡皂苷A是從柴胡中提取的三萜皂苷，具有廣泛的藥理活性[13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)柴胡皂苷A處理后，大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)犯錯(cuò)次數(shù)減少；新異臂進(jìn)入次數(shù)增加，海馬神經(jīng)元損傷減輕，腦梗死率，腦含水率和腦指數(shù)均降低，提示柴胡皂苷A能減緩腦缺血再灌注引起的腦損傷，起到腦保護(hù)的作用。

凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑由胱天蛋白酶介導(dǎo)，其中，caspase-3和caspase-9是凋亡過程中的關(guān)鍵介體。凋亡途徑可以通過caspase-9啟動(dòng)，并通過切割下游執(zhí)行者caspase-3觸發(fā)凋亡[14,15]。作為Bcl-2家族的2種典型蛋白質(zhì)，Bcl-2和Bax在caspase依賴性細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，主要位于細(xì)胞核和線粒體膜上，而促進(jìn)凋亡的家族成員Bax主要位于細(xì)胞質(zhì)中。Bcl-2在抑制Bax誘導(dǎo)的caspase依賴性凋亡方面具有很強(qiáng)的抗凋亡作用。因此，高比例的Bcl-2/Bax被認(rèn)為具有抗凋亡的作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷A能夠通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族介導(dǎo)caspase-3依賴性和獨(dú)立性的凋亡，導(dǎo)致線粒體功能障礙和凋亡因子的釋放[17]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)柴胡皂苷A處理后，Bax/Bcl-2，Cleaved caspase3/caspase3 和 Cleaved caspase9/caspase9蛋白表達(dá)水平的比值降低，提示柴胡皂苷A能夠抑制腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元凋亡。

氧化應(yīng)激可與細(xì)胞膜、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等細(xì)胞的幾種基本成分相互作用[18]。據(jù)報(bào)道，在炎癥條件下，脂質(zhì)氧化的標(biāo)志物MDA的濃度非常高，其濃度與氧化負(fù)荷的程度有關(guān)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷A處理能提高抗氧化酶（Nrf2，HO-1，SOD，GSH，GST和過氧化氫酶）活性，降低MDA含量，因此證實(shí)柴胡皂苷A不僅通過抑制活性氧的產(chǎn)生來(lái)提高抗氧化酶的水平，還可通過抑制脂質(zhì)過氧化來(lái)增強(qiáng)其抗氧化潛能[20]。本研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷A處理后，SOD活性升高，MDA和LDH的含量降低，提示柴胡皂苷A可緩解腦缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激。

沉默信息調(diào)節(jié)器1（silent information regulator 1，SIRT1）有助于細(xì)胞調(diào)節(jié)。SIRT1是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的保護(hù)因子，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)并適應(yīng)細(xì)胞代謝[21]。SIRT1促進(jìn)自噬并減少缺氧誘導(dǎo)的凋亡，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧應(yīng)激的影響[22]。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SIRT1可以促進(jìn)自噬并抑制體外細(xì)胞凋亡，因此對(duì)氧葡萄糖剝奪/再灌注誘導(dǎo)的損傷具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用[23]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)柴胡皂苷A處理后，SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，提示柴胡皂苷A對(duì)腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元損傷緩解作用與SIRT1上調(diào)有關(guān)。

綜上所述，胡皂苷A能緩解缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元損傷和氧化應(yīng)激，其機(jī)制與SIRT1上調(diào)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)可為防治缺血性腦血管疾病的臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)和思路。