利用Red/ET重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)非洲豬瘟病毒CP530R和F317L基因的重組偽狂犬病毒

孔 潔,邵洋洋,喬延召,趙琪琪,李鴻鑫,張新珩,藺文成,陳偉國(guó),謝青梅 (華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

自2018年8月以來(lái)，我國(guó)已有多個(gè)省份發(fā)生非洲豬瘟(African swine fever，ASF)疫情，ASF給我國(guó)養(yǎng)殖行業(yè)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。ASF是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的豬的一種急性、烈性傳染性疾病[1]，鑒于目前該疫病在全球多個(gè)國(guó)家蔓延，開(kāi)展疫情防控工作、研發(fā)新型ASF疫苗已迫在眉睫。ASFV屬于雙股線型DNA病毒，具有多層結(jié)構(gòu)和二十面體形態(tài)，其基因組編碼超過(guò)150多種病毒蛋白[2-3]。pp62多聚蛋白是ASFV非常重要的一類結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白可以加工合成兩個(gè)核心蛋白——p35和p15，存在于病毒顆粒的核殼，由CP530R基因編碼合成[4]。研究發(fā)現(xiàn)，pp220是病毒內(nèi)部核心殼的主要成分之一，兩種多聚蛋白前期的加工都伴隨著病毒的組裝，當(dāng)pp62多聚蛋白的表達(dá)受到阻遏，間接影響pp220多聚蛋白的離域化[5]，引起病毒工廠中具有不同核心發(fā)育水平的異常病毒顆粒積聚。未知蛋白(hypothetical proteins)是指缺少功能注釋信息的蛋白[6]。在成熟的ASFV粒子中，目前已檢測(cè)到68種蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒的復(fù)制和病毒粒子的形成，至今仍未知其功能的蛋白質(zhì)占30%左右，其中包括F317 L[7]。

偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病，臨床上能夠引起豬的繁殖障礙。該病毒基因組龐大，全長(zhǎng)約145 kb，由于病毒感染宿主范圍廣，且含有多個(gè)非必需基因，可供多種外源基因插入并穩(wěn)定表達(dá)[8]。已有研究表明，復(fù)制非必需區(qū)基因(TK、PK、gE、gI和gG等)能夠作為外源基因的插入位點(diǎn)，缺失突變后可使野生株P(guān)RV侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9]，顯著降低病毒毒力。迄今為止,已有多種標(biāo)記基因和致病微生物的中和抗原基因在該病毒中獲得穩(wěn)定表達(dá)[10]，目前該病毒已成為多種新型活載體疫苗的理想載體。

重組病毒活載體疫苗是利用DNA重組等一系列基因工程技術(shù)，通過(guò)對(duì)特定病毒的基因組進(jìn)行改造，將外源性抗原基因插入到載體病毒中進(jìn)行表達(dá)的一類新型疫苗[11]?！癛ed/ET重組”是近年發(fā)展起來(lái)的一種基于同源重組原理在大腸桿菌中直接修飾各類DNA分子的新技術(shù)[12]。Red/ET重組技術(shù)是利用重組酶Redα/β或RecE/T介導(dǎo)的同源重組對(duì)DNA精確修飾的技術(shù)[13]。與傳統(tǒng)的方法比較，該技術(shù)具有不受酶切位點(diǎn)限制，不受基因大小限制、無(wú)痕修飾、快速操作等優(yōu)點(diǎn)。利用該技術(shù)可以對(duì)多株重組病毒目的基因進(jìn)行修飾[14-15]。為了減少背景菌落影響，提高篩選效率，利用反向篩選標(biāo)記ccdB以獲得修飾的目的DNA，充分展示了該技術(shù)結(jié)合反向篩選標(biāo)記ccdB的可操作性和實(shí)行性。本研究利用Red/ET重組工程技術(shù)和ccdB反向篩選標(biāo)記，將ASFV CP530R和F317L同時(shí)插入到PRV TK位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)ASFV CP530R和F317L基因的重組PRV，為ASFV新型活載體疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料真核表達(dá)載體pVAX1購(gòu)自Invitrogen公司；E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；Gel Extractin Kit、Plasmid Kit、Cycle Pure Kit均購(gòu)自O(shè)MEGA；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Biolabs公司；克隆載體pMD-19T Vector、DNA 聚合酶、DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；PUC57-CMV-CP530R-F317L-BGH質(zhì)粒由上海生工生物公司合成；質(zhì)粒pBeloBAC11-cm和表達(dá)重組蛋白R(shí)ecE/RecT的E.coliGBred/GBredA462感受態(tài)由山東大學(xué)張友明教授惠贈(zèng)；PRV(Bartha-K61)毒株、rBartha-K61-EGFP(TK)重組毒株、pBeloBAC11-cm-Bartha-K61質(zhì)粒、Vero細(xì)胞、PK-15細(xì)胞均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽研究室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR引物設(shè)計(jì)及合成以PBR322-Amp-ccdB質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增含HA同源臂的(TK)-Amp-ccdB-(TK)載體(篩選標(biāo)記基因片段)。F1：5′-CTCGGCGGGGCGCTGTACGTGCCCGAGCCG-ATGGCGTACTTTAATTAATTTGTTTATTT-TTCTAAATA-3′；R1：5′-GGAAGCACACCGTC-GCGGCCACCGGGTGGCGGTCAAAGACTTAA-TTAATTATATTCCCCAGAACATCAG-3′(限制性內(nèi)切酶PacⅠ酶切位點(diǎn))；以PUC57-CMV-CP530R-F317L-BGH質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增含HA同源臂的基因片段((TK)-CMV-CP530R-F317L-BGH-(TK))。F2：5′-CTCGGCGGGGCGCTGTACGTGCCCGAGCCGATGGCGTACTTTAATTAAGA-CATTGATTATTGACTAGT-3′；R2：5′-GGAAGCACACCGTCGCGGCCACCGGGTGGCGGTCA-AAGACTTAATTAATGTCCATAAAACCGCC-CAGT-3′(限制性內(nèi)切酶Pac Ⅰ酶切位點(diǎn))。

PCR反應(yīng)體系：2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25 μL，Template DNA 1 μL，引物(F/R)各2 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 3 min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果并測(cè)序。

1.3 重組病毒的構(gòu)建及兩步法轉(zhuǎn)化由上海生工生物合成的ASFV抗原基因來(lái)源于中國(guó)流行毒株P(guān)ig/CN/HLJ/2018(GenBank：MK333180.1)，命名為：PUC57-CMV-CP530R-F317L-BGH。以PBR-322-Amp-ccdB為模板，(TK)Amp-ccdB-F/(TK)Amp-ccdB-R為引物，PCR擴(kuò)增(TK)-Amp-ccdB-(TK)篩選標(biāo)記基因片段。以基因合成的質(zhì)粒為模板，利用通用引物(TK)CMV-F/(TK)BGH-R，PCR方法擴(kuò)增外源基因片段，命名為：(TK)-CMV-CP530R-F317L-BGH-(TK)。

將制備好的基因片段(TK)-Amp-ccdB-(TK)與pBeloBAC11-cm-Bartha-k61載體進(jìn)行同源重組，將RecE/RecT重組蛋白轉(zhuǎn)化至感受態(tài)GB redA462，涂布于Amp抗性的LB平板，重組質(zhì)粒命名為 pBeloBAC11-cm-Bartha-k61-(TK)-Amp-ccdB-(TK)，完成與環(huán)狀載體第1步重組病毒的轉(zhuǎn)化。將制備好的基因片段(TK)-CMV-CP530R-F317L-BGH-(TK)與pBeloBAC11-cm-Barthak61-(TK)-Amp-ccdB-(TK)質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，將RecE/RecT重組蛋白轉(zhuǎn)化至感受態(tài)GB red，涂布于氯霉素抗性的LB平板，進(jìn)行第2步重組病毒的轉(zhuǎn)化。

1.4 感染性克隆的篩選與鑒定電轉(zhuǎn)完成后立即加入1 mL SOC培養(yǎng)基至電擊杯中，將菌體重懸并轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，37℃，260 r/min培養(yǎng)1 h完成重組及抗性復(fù)蘇。3 000 r/min離心1 min沉淀菌體，保留部分上清并吹打重懸，涂布含有Amp抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆菌落，37℃，260 r/min培養(yǎng)12 h。以(TK)CMV-F/(TK)BGH引物進(jìn)行菌液PCR初步鑒定，提取質(zhì)粒進(jìn)行Pac Ⅰ酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為：pBeloBAC11-cm-Bartha-k61-(TK)- CP530R-F317L-(TK)。

1.5 病毒拯救鑒定用鑒定正確的重組質(zhì)粒pBeloBAC11-Bartha-K61-(TK)CMV-CP530R-F317L-BGH按照LipoTM3000說(shuō)明書轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞及上清，接種至PK-15細(xì)胞，盲傳5代，收獲病毒液進(jìn)行拯救病毒鑒定。病毒感染后出現(xiàn)空泡等典型噬斑狀態(tài)，酶切正確的克隆命名為：rBartha-K61-CP530R-F317L，抽提病毒基因組DNA，PCR擴(kuò)增基因片段并進(jìn)行鑒定。

取rBartha-K61-CP530R-F317L株病毒液接種至PK-15細(xì)胞(MOI=1)，收取細(xì)胞，一抗使用鼠源Flag標(biāo)簽蛋白多克隆抗體(1∶750稀釋)進(jìn)行孵育，二抗使用FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000稀釋)進(jìn)行孵育，Western blot鑒定蛋白表達(dá)。

1.6 感染性克隆的穩(wěn)定性試驗(yàn)將感染性克隆rBartha-K61-CP530R-F317L以MOI=1接種PK-15細(xì)胞，48 h產(chǎn)生明顯病變，反復(fù)凍融3次后收獲病毒，一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定病毒TCID50。連續(xù)傳代20次，每隔5代提取感染性克隆的基因組DNA，按照1.4方法進(jìn)行PCR鑒定，第20代按照1.5方法進(jìn)行Western blot鑒定。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及測(cè)序含有同源臂的目的基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，目的條帶大小約為2 671 bp(圖1A)，擴(kuò)增片段與預(yù)期大小一致，膠回收目的條帶并進(jìn)行克隆測(cè)序；Amp-ccdB篩選標(biāo)記基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，目的條帶大小約為1 307 bp(圖1B)，擴(kuò)增片段與預(yù)期大小一致，膠回收目的條帶并進(jìn)行克隆測(cè)序。

A.含有同源臂的目的基因；B.Amp-ccdB篩選標(biāo)記基因圖1 含有同源臂的CP530R-F317L基因和Amp-ccdB片段擴(kuò)增結(jié)果

2.2 真核表達(dá)重組質(zhì)粒鑒定將目的基因定向克隆到真核表達(dá)載體上，使用質(zhì)粒抽提試劑盒對(duì)陽(yáng)性菌液進(jìn)行抽提，限制性內(nèi)切酶PacⅠ對(duì)抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示在3 646,7 516,58 803,78 782 bp處可見(jiàn)4條與預(yù)期大小一致的條帶(圖2)，膠回收目的條帶并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果顯示正確，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.3 真核表達(dá)重組質(zhì)粒篩選將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞后48 h收獲細(xì)胞及上清，接種PK-15細(xì)胞，盲傳至第5代時(shí)，PK-15細(xì)胞膨大變圓，隨之細(xì)胞變性圓縮，最后細(xì)胞脫落聚集，形成空斑等典型CPE現(xiàn)象(圖3)，將該拯救毒株命名為rBartha-K61-CP530R-F317L，連續(xù)傳代20代后未發(fā)現(xiàn)變異。

A.空白對(duì)照細(xì)胞；B.感染后的細(xì)胞病變圖3 重組病毒質(zhì)粒感染PK-15細(xì)胞病變

2.4 感染性克隆的穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.1感染性克隆的蛋白鑒定 以rBartha-K61-CP530R-F317L為模板，PCR擴(kuò)增含同源臂的目的基因，目的條帶與預(yù)期大小一致。為驗(yàn)證感染性克隆的蛋白表達(dá)情況，將rBartha-K61-CP530R-F317L感染性克隆，以MOI=1接種至細(xì)胞培養(yǎng)6孔板單層PK-15細(xì)胞,使用帶有HA標(biāo)簽多克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖4)，rBartha-K61-CP530R-F317L感染性克隆組檢測(cè)到HA標(biāo)簽蛋白，疫苗株Bartha-K61未檢測(cè)到HA標(biāo)簽蛋白。

圖4 感染性克隆的蛋白鑒定

2.4.2感染性克隆的一步生長(zhǎng)曲線 利用Reed-Muench法[16]計(jì)算Bartha-K61疫苗株、rBartha-K61-EGFP(TK)、rBartha-K61-CP530R-F317L重組病毒不同時(shí)間點(diǎn)的TCID50，繪制一步生長(zhǎng)曲線(圖5)。重組病毒能在PK-15易感細(xì)胞上快速增殖，病毒滴度峰值可達(dá)105.8TCID50/mL，與原始毒株Bartha-K61存在差異，但與rBartha-K61-EGFP(TK)重組毒株無(wú)明顯差異(表1)。

圖5 感染性克隆的一步生長(zhǎng)曲線

表1 不同時(shí)間點(diǎn)病毒滴度測(cè)定(lgTCID50)

3 討論

自2018年8月至今，ASF在全球范圍內(nèi)的廣泛傳播造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，ASF疫情的流行特征及動(dòng)態(tài)變化迫切要求有效的預(yù)防控制措施，開(kāi)發(fā)及研制高效、安全的新型疫苗具有重要的研究意義。在宿主和病毒長(zhǎng)期共存的漫長(zhǎng)過(guò)程中，病毒進(jìn)化了各種免疫逃逸機(jī)制以逃避宿主的免疫應(yīng)答[17-19]，ASFV擁有復(fù)雜且龐大的基因組，編碼多種免疫逃逸蛋白抑制宿主免疫應(yīng)答，使得該病尚未有有效疫苗問(wèn)世[20-22]，現(xiàn)階段在做好ASFV防控保障工作的同時(shí)，越來(lái)越多的國(guó)家將工作重心趨向于研究新型ASF疫苗以此進(jìn)行免疫評(píng)估。

目前，針對(duì)ASF預(yù)防在畜禽研究中的范圍和內(nèi)容十分廣泛，尤其是在臨床病例中不同類型疫苗的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用。早期ASF疫苗研制的重心主要聚焦于滅活疫苗，但前期研究表明，ASFV滅活疫苗雖可刺激機(jī)體產(chǎn)生不同強(qiáng)度的免疫應(yīng)答，但仍無(wú)法誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和性抗體，尚未呈現(xiàn)良好的中和作用。BLOME等[23]研究發(fā)現(xiàn)，使用新型佐劑(PolygenTM或Emulsigen?-D)與滅活的ASFV疫苗配伍，均可檢測(cè)到ASFV特異性抗體，但未觀察到免疫的保護(hù)作用。與基因缺失減毒活疫苗相比，DNA疫苗是將病毒編碼的主要蛋白基因通過(guò)克隆等一系列方式插入真核表達(dá)載體，構(gòu)成重組真核表達(dá)載體刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。ARGILAGUET等[24]將ASFV血凝素(sHA)的胞外域與兩種病毒抗原——p54和p30融合后，雖可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，但無(wú)法起到攻毒保護(hù)，研究者進(jìn)一步將新的重組質(zhì)粒pCMV-UbsHAPQ與泛素融合的病毒決定簇——sHA，p54和p30，發(fā)現(xiàn)僅能夠改善并刺激機(jī)體產(chǎn)生部分免疫保護(hù)。安全性是影響弱毒活疫苗臨床應(yīng)用最關(guān)鍵的影響因素之一[25]，ASFV弱毒活疫苗主要分為3類——傳代致弱、重組致弱和天然致弱。KRUG等[26]將ASFV-G野毒株在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代110次，體外評(píng)估獲得病毒在Vero細(xì)胞和豬原代巨噬細(xì)胞中復(fù)制的能力，體內(nèi)評(píng)估對(duì)豬的毒性，病毒全長(zhǎng)序列分析顯示出病毒具有明顯的缺失。重組活載體疫苗是指將病毒的保護(hù)性抗原通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)插入到病毒載體上，以期獲得有效的免疫反應(yīng)和免疫保護(hù)。引起體液和細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的策略是使用病毒載體。LOKHANDWALA等[27]首次采用“雞尾酒療法”，將多種抗原混合物與佐劑配伍使用，快速誘導(dǎo)了ASFV抗原特異性抗體及針對(duì)所有抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)，該項(xiàng)研究首次證明使用Ad-ASFV多種抗原共同誘導(dǎo)商業(yè)豬抗原特異性CTL反應(yīng)?，F(xiàn)階段，仍需要進(jìn)行大量的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證重組活載體疫苗的安全性和必要性。

Red/ET重組技術(shù)是建立在同源重組基礎(chǔ)上，對(duì)大腸桿菌中DNA分子進(jìn)行高效修飾的遺傳工程技術(shù)。Red/ET技術(shù)由重組酶——Redα/β或RecE/T催化DNA分子，Redα/β是由來(lái)源于λ噬菌體的pL操縱子的redα和redβ基因編碼的重組蛋白；RecE/T是分別由來(lái)源于E.coliRac前噬菌體的recE和recT基因編碼的重組蛋白[28]。研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)“線線”重組，重組酶RecE/T比Redα/β介導(dǎo)效率更高，而 Redα/β介導(dǎo)“線環(huán)”重組效率更高，Redα/β蛋白能夠高效介導(dǎo)線性DNA分子和環(huán)狀DNA分子之間發(fā)生同源重組[29-30]。利用Red/ET重組對(duì)目的基因進(jìn)行修飾，為了減少背景菌落影響，提高篩選效率，科研人員提出了“兩步走”的策略[31]。常用的正篩選標(biāo)記包括各種抗生素抗性基因等，負(fù)篩選標(biāo)記包括sacB、rspL、galK和ccdB等[32]。ccdB會(huì)通過(guò)促進(jìn)遺傳物質(zhì)的廣泛損傷來(lái)快速殺滅細(xì)菌，作用于的靶標(biāo)是解旋酶的GyrA亞基，阻止DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

本研究利用Red/ET重組工程技術(shù)和ccdB反向篩選技術(shù)，將ASFV特定基因——CP530R-F317L，定向插入到PRV TK位點(diǎn)，最終表達(dá)ASF的特定抗原基因，重組活載體疫苗具有良好的遺傳穩(wěn)定性和增殖型，為新型ASFV疫苗的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。