造紙法再造煙葉廢水中微生物多樣性分析

馮文超， 李 軍， 劉永龍， 許炎坤， 李 東， 陶宏兵， 謝小保

1.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510063; 2.中山大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，廣東 珠海 519082;3.廣東省防霉抗菌工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070;4.廣東省科學(xué)院微生物研究所 華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室，廣東 廣州 510070

造紙法再造煙葉廢水含豐富的有機(jī)物種類，如芳香酸和環(huán)己羧酸，含氮雜環(huán)(包括尼古丁)、芳香烴和酯類[1, 2]。廢水處理過程中，各種主要污染物降解及代謝過程復(fù)雜。膜生物反應(yīng)器(MBR)/反滲透(RO)組合系統(tǒng)是近年來廣受關(guān)注[3-5]的用于處理再造煙葉廢水的新技術(shù)，通常與其他技術(shù)聯(lián)用[6-9]，可以更高效、環(huán)保的去處如微粒、高濃度有機(jī)物、有毒污染物和病原微生物[10-12]等污染物。

MBR膜表面可聚集大量微生物種群，在廢水通過膜過濾之前完全清除污染物。另外，由于膜的篩分作用，保留了分子量大于膜分子量截留值的污染物，從而使其與MBR內(nèi)部的降解微生物接觸以使其完全降解[10]。微生物種群多樣性是影響MBR處理效果的重要因素之一，但相關(guān)研究目前少見報道。

本文采用16S rRNA基因高通量測序?qū)υ颇夏吃旒埛ㄔ僭鞜熑~生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)活性污泥中微生物多樣性進(jìn)行分析，考察了再造煙葉廢水處理過程中的活性污泥中細(xì)菌的多樣性，活性污泥細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，探究其在降解有機(jī)污染物和無機(jī)污染物以及降低廢水水質(zhì)色度方面的活性和廣譜性，以確保造紙法再造煙葉生產(chǎn)廢水處理效果的穩(wěn)定性和高效性，并為后續(xù)功能微生物的篩選和MBR/RO工藝的開發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

云南某造紙法再造煙葉生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)曝氣池中活性污泥；總DNA提取試劑盒(DNA Isolation kit，MO BIO PowerSoil，美國)；DNA凝膠回收試劑盒(AxyPrep，研卉生物，上海)；載體連接試劑盒(pSURE-T，研謹(jǐn)生物，上海)；凝膠成像儀(170-8170，Bio-Rad，美國)；X射線熒光光譜儀(PW4400/40，Bruker，德國)；變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)(DCodeTM System，Bio-Rad，英國)。

1.2 方法

1.2.1DNA提取

樣品的總DNA通過細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取，DNA質(zhì)量用瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用通用引物16S rRNA基因序列對總DNA擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠回收試劑盒純化[13]。

1.2.216S rRNA基因文庫構(gòu)建

經(jīng)過感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和載體片段連接，培養(yǎng)出可見單克隆菌落，之后放置在4 ℃冰箱30 min顯色，挑取白色菌斑的陽性克隆，用載體連接試劑盒轉(zhuǎn)接至含氨芐抗生素的LB瓊脂平板(Lysogeny Broth)中，培養(yǎng)作為一個文庫。之后經(jīng)過菌落PCR擴(kuò)增篩選，分析電泳結(jié)果。采用Neighbor-Joining法對樣品進(jìn)行微生物系統(tǒng)發(fā)育分析，使用QIIME程序構(gòu)建最終的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品中總DNA提取和PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))產(chǎn)物純化

如圖1所示，電泳條帶長度在5 000 bp～8 000 bp之間，條帶清晰明亮，說明可以用于后續(xù)的純化和文庫構(gòu)建相關(guān)實驗。

圖1 污泥樣品總DNA的提取效果檢測

上述樣品中的總DNA擴(kuò)增采用了通用引物16S rRNA基因序列，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠回收試劑盒純化后，其條帶長度1 500 bp左右，如圖2所示，符合后續(xù)構(gòu)建基因組文庫的要求。

圖2 污泥樣品細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 16S rRNA基因文庫構(gòu)建

經(jīng)過菌落PCR擴(kuò)增篩選電泳結(jié)果如圖3所示，其中條帶清晰明亮，共得到條帶長度約1 500 bp的陽性克隆共91個。

圖3 污泥樣品類群分析

2.3 廢水污泥中微生物多樣性分析

對造紙法再造煙葉廢水污泥菌群文庫中的78個陽性克隆測序，得到60個OTU(operational taxonomic units操作分類單元)。樣品中的微生物多樣性分析結(jié)果如表1。樣品中香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener Index)為3.956 547，說明群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在文庫測序中條帶所含有的信息量大。辛普森多樣性指數(shù)(Simpson Index)達(dá)到了0.976 2186，接近1，說明群落中細(xì)菌種類多，且個體分布均勻。菌種豐富度指數(shù)(Chao-1)為235，表明樣品中微生物種群豐度和多樣性很高?？傊钚晕勰嘀械奈⑸锶郝浞N群豐富、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多樣性較高，且分布均勻，為廢水處理的持續(xù)穩(wěn)定運行發(fā)揮了重要作用。但由于生物總量較低，僅有6.25×107個/mL，且分布過于均勻，也制約了對重要污染物的降解。

表1 污泥樣品微生物群落多樣性分析

同時采用Neighbor-Joining法對樣品進(jìn)行微生物系統(tǒng)發(fā)育分析。使用QIIME程序構(gòu)建最終的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。造紙法再造煙葉廢水污泥樣品的克隆文庫中60個OUT(見圖5)，主要屬于細(xì)菌域的7個主要類群，包括變形菌門(Proteobacteria)占總數(shù)的48.7%，放線菌門(Actinobacteria)占總數(shù)的11.5%，硝化螺旋菌門(Nitrospira)占總數(shù)的5.1%，擬桿菌門(Bacteriodetes)占總數(shù)的5.1%，綠彎菌門(Chlorobacteria)占到總數(shù)的5.1%，未培養(yǎng)菌(Uncultured bacterium)占總數(shù)的15.4 %和其他種類占總數(shù)的9.0 %。

圖4 污泥樣品細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 污泥樣品細(xì)菌群落組成

(1)變形菌門

對細(xì)菌域中的主要類群進(jìn)行含量統(tǒng)計和分析，發(fā)現(xiàn)污泥樣品中屬于變形菌門(Proteobacteria)的克隆占總數(shù)的48.7%，目前文獻(xiàn)報道在多數(shù)情況下常規(guī)活性污泥菌群中變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢類群。變形菌門在活性污泥群落中成為優(yōu)勢類群，主要原因在于環(huán)境中這一門中的微生物存在的數(shù)量和種類占有絕對優(yōu)勢。

變形菌門細(xì)胞參與了各類活性污泥中大多數(shù)化合物的降解代謝，其形態(tài)和代謝種類多樣，其外膜主要成分為脂多糖組成，其中有一類獨特的黏細(xì)菌，可以聚集形成多細(xì)胞的子實體。大多數(shù)變形菌門細(xì)菌具有營兼性、專性厭氧或異養(yǎng)的生活特性，因此活性污泥中的微生物群落也具備結(jié)構(gòu)多樣和代謝活性復(fù)雜多樣性，也因而保證了有機(jī)化合物在降解過程中的形成“共代謝”機(jī)制，保障了降解的穩(wěn)定性和徹底性。

同時發(fā)現(xiàn)，在克隆文庫中，變形菌門(Proteobacteria)中β-變形菌綱是主要的優(yōu)勢菌群，占變形菌門的47.4%；其次是α-變形菌綱，占變形菌門的36.8%，δ-變形菌綱和γ-變形菌綱分別占變形菌門的10.5%和5.3%(見圖6)。污泥樣品中的β-變形菌綱不僅在數(shù)量上占優(yōu)勢，而且其中包括的亞硝化單胞菌目和硫桿菌屬也在廢水的脫氮除硫環(huán)節(jié)起到重要作用，同時其中的微生物在降解有機(jī)物、去除營養(yǎng)物質(zhì)等方面也具有重要作用，是活性污泥中的主要類群之一。α-變形菌綱中的微生物經(jīng)過Blast比對，序列大多來源于廢水處理廠或活性污泥樣品，比對結(jié)果符合煙草廢水污泥樣品的特點。

圖6 污泥樣品中變形菌門各綱分布

(2)放線菌門

放線菌門(Actinobacteria)所包含微生物見表2，數(shù)量占廢水處理系統(tǒng)中群落總數(shù)的11.5 %，也屬于本次樣品中群落結(jié)構(gòu)分析中的主要類群之一，對有機(jī)物的降解去除和降低COD有主要的貢獻(xiàn)。放線菌門中的菌種，在分解酚、吡啶、甘油醇、甾族、芳香族、石蠟等許多種復(fù)雜的有機(jī)物中都有研究報道，包括類諾卡氏菌(Nocardioidessp.)，一種產(chǎn)丙酸假單胞菌(Propionicimonaspaludicola)等。放線菌門在廢水處理過程中的表曝池和IC池中對污染物降解方面是主要貢獻(xiàn)者之一。

表2 污泥樣品中放線菌門所包含的微生物

(3)硝化螺旋菌門和擬桿菌門

硝化螺旋菌門(Nitrospira)所包含微生物如表3，在污泥樣品中占5.1 %。其中的硝化螺旋菌屬(Nitrospira sp.)作為硝化細(xì)菌(Nitrifier)，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽。結(jié)合煙草廢水污泥文庫β-變形菌門中的亞硝化單胞菌，廢水處理系統(tǒng)可以完成氨氮的去除。

表3 污泥樣品中硝化螺旋菌門、擬桿菌門和綠彎菌門所包含的微生物

文庫中綠彎菌門(Chlorobacteria)中的細(xì)菌比對結(jié)果顯示，序列來源于活性污泥樣品，而擬桿菌門(Bacteriodetes)中的Flavobacteriumsp.有可能存在于污泥的膨脹過程中，但從該類微生物在群落中的比例來看，其比例較小，在進(jìn)水水質(zhì)穩(wěn)定的情況下，這種情況發(fā)生的幾率較小。這一部分中的微生物群落組成較為復(fù)雜，有益菌和有害菌同時存在，可以通過生物強化和處理參數(shù)的優(yōu)化，對其中的有害微生物加以抑制，提高有益微生物的存在比例和降解有機(jī)/無機(jī)污染物的效率，進(jìn)一步提高出水水質(zhì)，達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)。

硝化螺旋菌門(Nitrospira)是存在于廢水處理廠和實驗室反應(yīng)器中主要的亞硝酸氧化菌，在水體中，硝化螺旋菌門對氨氮/硝酸鹽/亞硝酸鹽循環(huán)體系至關(guān)重要，這同上述菌群分析結(jié)果一致。

(4)擬桿菌門

擬桿菌門(Bacteriodetes)在污泥樣品中占5.1%，很多擬桿菌門的種類，如黃桿菌綱(flavobacteria)，在水生環(huán)境和食物中均有存在，它們在有機(jī)物的降解中貢獻(xiàn)著自己特有的活性，鞘脂桿菌綱重要類群為噬胞菌(Cytophaga)，在海洋細(xì)菌中占有較大比例，可以降解纖維素。在造紙法再造煙葉生產(chǎn)廢水中，對于木質(zhì)素、纖維素等大分子難降解有機(jī)物中起主要作用。

(5)綠彎菌門

綠彎菌門(Chloroflexi)又稱作綠非硫細(xì)菌，在污泥樣品中占5.1 %，這一類細(xì)菌具有綠色的色素，可以通過光合作用產(chǎn)生能量，在廢水處理中的主要作用是光合自養(yǎng)產(chǎn)生能量，在微生物菌群對污染物的“共代謝”過程中起到鏈接上下游反應(yīng)的作用，所以對于大型表曝池廢水的處理過程具有積極的意義。

(6)其他菌門

除上述主要種群外，還發(fā)現(xiàn)了少量的梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacterium)，共占文庫的9.0 %，是活性污泥樣品中常見的微生物類群見表4。酸桿菌門中有微生物可以降解脂肪烴類有機(jī)物，同時經(jīng)過分析也可發(fā)現(xiàn)有少量的對于有機(jī)物降解和COD去除不利的微生物成員的存在，但在有益微生物大量存在和繁殖的情況下，這類有害微生物的影響較小。

表4 污泥樣品中其他菌門所包含的微生物

3 結(jié)論

(1)造紙法再造煙葉生產(chǎn)廢水活性污泥中包含變形菌門(48.7%)、放線菌門(11.5%)、硝化螺旋菌門(5.1%)、擬桿菌門(5.1%)、綠彎菌門(5.1%)、未培養(yǎng)菌(15.4 %)和其他種類(9.0 %)等細(xì)菌域的7個主要類群。

(2)變形菌門在活性污泥群落中成為優(yōu)勢類群，變形菌門中β-變形菌綱是主要的優(yōu)勢菌群，占變形菌門的47.4%，其次是α-變形菌綱，占變形菌門的36.8%。放線菌門所包含微生物數(shù)量占廢水處理系統(tǒng)中群落總數(shù)的11.5 %，也屬于本次樣品中群落結(jié)構(gòu)分析中的主要類群之一。

(3)活性污泥中微生物中所包含的菌門數(shù)，占到了目前細(xì)菌域中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的菌門中的80 %，顯示了活性污泥的物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，從側(cè)面也佐證了其在生化降解有機(jī)污染物和無機(jī)污染物以及降低廢水水質(zhì)色度方面的獨特活性和廣譜性，為再造煙葉生產(chǎn)廢水處理效果的穩(wěn)定性和高效性提供了重要的保障。