添加劑預混合飼料中洛克沙胂測定的方法優(yōu)化

◆作者：鄭勝蘭 耿士偉 尹原妍 賈書靜

◆單位：江蘇省畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心

洛克沙胂是一種有機砷制劑，易溶于甲醇、乙醇、乙酸、丙酮和堿溶液，微溶于冷水，可用于豬、雞促進生長，并起到抗菌、抗球蟲的作用。作為飼料添加劑，洛克沙胂可使機體同化作用加強，促進蛋白質(zhì)合成，改善皮膚營養(yǎng)，增強骨髓的造血機能，提高飼料報酬，改善胴體品質(zhì)（錢潮海等，2010；聶新志等，2008；趙春華等，2019）雖然洛克沙胂絕大多數(shù)以化合物形式隨糞便和尿液排出體外，但是在微生物氧化、礦物氧化和光解等條件下，它容易被轉(zhuǎn)化成高致毒性的無機砷，造成二次環(huán)境污染（A.J.Bednar等，2003；John F.Stolz等，2007；Irail Cortinas等，2006）。為保障動物產(chǎn)品質(zhì)量安全，維護公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全，農(nóng)業(yè)部于2018年1月發(fā)布農(nóng)業(yè)部第2638號公告，禁止在食品動物中使用洛克沙胂。

目前，飼料中洛克沙胂的檢測遵循的標準是禁令頒布前的舊國標GB/T 22146-2008。顯然，該標準已經(jīng)不能適應當前日常檢驗的需求，急需重新制定新標準。在標準制定過程中，我們發(fā)現(xiàn)，按照原標準指定的方法操作時，有部分添加劑預混合飼料復溶加標回收率表現(xiàn)不理想。因此，預混合飼料中洛克沙胂的檢測方法，特別是前處理過程亟待優(yōu)化。本文對預混合飼料的檢測方法，特別是前處理方法的部分進行了較為深入的研究探索。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

甲醇（色譜純，默克）；乙腈（色譜純，默克）；甲醇（分析純，國藥）；甲酸（色譜純，美國ACS）；磷酸氫二鉀（分析純，滬試）；磷酸二氫鉀（分析純，滬試）；磷酸（分析純，滬試）；洛克沙胂標準品（98.5%，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）。

1.2 主要儀器和設備

Waters2695高效液相色譜儀，配有紫外檢測器檢測器（美國waters公司）；MAX固相萃取小柱（150 mg/6 mL，美國waters公司）；微孔濾膜（0.45μm，美國安捷倫公司）。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：水相為含有0.1%甲酸的0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，有機相為乙腈，有機相+水相=9+91（體積比）；柱溫：30℃；檢測波長：266 nm；進樣量：20μL

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱取試樣2g，準確至0.01g，置于50 mL離心管中，準確加入20.00 mL 20 g/L磷酸氫二鉀溶液，振蕩提取20 min，離心10 min，取上清液5.00 mL于試管中，加入0.5 mL 10%磷酸水溶液，混勻備用。

1.4.2 凈化

固相萃取小柱依次用5 mL甲醇和5 mL水預淋洗，取備用液過柱，依次用5 mL水和5 mL 1%乙酸甲醇淋洗，吹干。用15%甲酸甲醇溶液5 mL洗脫，吹干，收集洗脫液，于50℃水浴下用氮氣吹干，用2.00 mL含有0.1%甲酸的10%甲醇溶液溶解，渦旋混勻，用0.45μm濾膜過濾，上機。

1.5 標準工作曲線

標準品以甲醇溶解定容得1mg/mL的標準儲備液，再以含有0.1%甲酸的10%甲醇溶液稀釋定容配制系列標準溶液，濃度 分別為：0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL。在優(yōu)化的色譜條件下進行測定，以洛克沙胂的濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.6 檢出限和定量限

選取空白基質(zhì)，向其中加入一定濃度的洛克沙胂對照品，按照優(yōu)化后的方法進行測定，依據(jù)信噪比（s/n）≥3及信噪比（s/n）≥10的原則，確定本方法的檢出限和定量限。

1.7 方法回收率測定

稱取不同基質(zhì)的試樣2g，準確至0.01g，置于50mL離心管中，加入洛克沙胂標準溶液，使洛克沙胂在飼料中的添加量為5 mg/kg、10 mg/kg和50 mg/kg，按樣品前處理方法處理樣品后上機測定。以洛克沙胂的色譜峰面積代入回歸方程計算方法回收率。

1.8 精密度測定

樣品處理及測定方法同1.6節(jié)，每個添加水平作6份平行測定，求得日內(nèi)標準偏差；選取洛克沙胂添加水平為10 mg/kg的加標樣，連續(xù)測定3天，求得日間標準偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相條件優(yōu)化

因為飼料樣品的雜質(zhì)較多，為獲得更好的分離選用長柱。在流動相水相的選擇上，通過查找相關文獻和對目標物性質(zhì)的分析，確定以含有0.1%甲酸的0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相的水相（張莉等，2014；中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2008）。流動相中有機相的選擇上，比較了甲醇和乙腈，結(jié)果表明由于乙腈的洗脫能力更強，以乙腈為有機相時，目標峰的出峰時間稍有提前，并且能更好的避開雜峰。最后確定流動相條件為有機相+水相=9+91(體積比)。在該條件下，洛克沙胂的峰形較好，與雜質(zhì)峰分離良好，未見明顯干擾，標準溶液和樣品的色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 1μg/mL洛克沙胂典型色譜圖

圖2 5mg/kg洛克沙胂添加量的復合預混合飼料（紅線）和空白樣品（黑線）的色譜圖

2.2 淋洗液和洗脫液的選擇

與文獻報道類似，我們通過實驗發(fā)現(xiàn)混合陰離子固相萃取柱更適合于有機酸的凈化富集。取5 mL 10μg/mL的標準溶液過已活化的MAX小柱，接柱后液上機測試，目標峰位置未出峰，表明目標物被有效的保留于小柱上。

同時，以分段分析的方式考察淋洗液和洗脫液。各取濃度為10μg/mL的洛克沙胂標準溶液分別過5個已活化的MAX小柱，分別以5 mL的純水、甲醇、5%甲酸甲醇、10%甲酸甲醇、15%甲酸甲醇淋洗，收集柱下液混勻后上機測試，將測得的目標峰峰面積與10μg/mL標準溶液峰面積的比值計算一次洗脫率。再次以上述淋洗液重復淋洗，收集柱下液混勻后上機測試，將測得的目標峰峰面積與10μg/mL洛克沙胂標準溶液的峰面積的比值計算二次洗脫率，結(jié)果如表1所示。

表1 不同溶液對洛克沙胂的洗脫效率

由表1可得出以下三點結(jié)論：首先，純水、甲醇對富集于小柱上的目標物沒有洗脫能力，可以作為淋洗液；第二，5%甲酸甲醇兩次洗脫均不能將目標物完全洗脫下來，而將濃度提升至10%和15%則可一次有效洗脫目標物；第三，在確定的淋洗液和洗脫液條件下，增加洗脫體積對結(jié)果不產(chǎn)生實質(zhì)性的影響。

我們連續(xù)5天跟蹤測定了10%甲酸甲醇溶液的pH值并重復洗脫率實驗，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，隨著時間的推移，溶液的pH值逐漸增大，而其對洛克沙胂的洗脫能力逐漸減弱。這主要是由于洛克沙胂的pKa1與甲酸的pKa值極為接近（分別為3.5和3.75），甲酸甲醇溶液pH值的微小變化將影響洛克沙胂與固定相之間的相互作用能力。而洛克沙胂為酸類物質(zhì)，洗脫溶液pH越小，目標物越容易從柱子上洗脫下來。但是，15%甲酸甲醇溶液放置一個月后pH值仍然保持在3.5左右，對洛克沙胂的一次洗脫率也能夠穩(wěn)定在100%左右。因此，我們最后選擇以15%甲酸甲醇溶液作為洗脫液，洗脫體積為5 mL。

圖3 甲酸甲醇溶液pH值變化與洗脫率的關系

2.3 提取液的選擇

由于洛克沙胂易溶于甲醇和稀堿，在水中略溶解。通過實驗結(jié)果并參考相關文獻，選取甲醇、0.5%氨水甲醇、50%甲醇、10%甲醇、20g/L磷酸氫二鉀溶液共5種提取液，在10 mg/kg的添加水平下考察實際樣品中目標物的提取效率。結(jié)果如表2所示。

由表2可知，含有機相的提取劑不適用于添加劑預混合飼料中洛克沙胂的提取。分析原因可能有兩個：第一，有機相的存在影響了飼料基質(zhì)中銅、鐵、錳、鋅等元素的溶解，而這些存在于沉淀中的帶正電的物質(zhì)吸附了帶負電目標物，起到了類似固定相的作用；第二，預混合飼料的輔料大多為石粉、沸石粉等無機礦物質(zhì)，這類物質(zhì)在有機相中的浸潤性相對較差，不利于目標物的提取。綜上，20g/L磷酸氫二鉀溶液對添加劑預混合飼料的提取效率均較為滿意，可作為添加劑預混合飼料的提取液。

表2 不同提取液對回收率的影響

2.4 上柱溶液pH值的考察

分別稱取7份試樣各2 g，準確至0.01 g，置于50 mL離心管中，加入洛克沙胂標準溶液，使洛克沙胂在飼料中的含量為2 mg/kg，準確加入20.00 mL 20 g/L磷酸氫二鉀溶液，振蕩提取20 min，離心10 min，分別取上清液5.00 mL于7個試管中，分別以10%磷酸水溶液調(diào)節(jié)樣液pH值為7、5、4.5、3.5、3、2.5和2，混勻，上柱凈化后上機。以洛克沙胂的峰面積代入回歸方程計算方法回收率，所得結(jié)果如圖4所示。

圖4 上樣液pH值對回收率的影響

由圖可知，當上柱液pH≥5時，目標物的回收率為0，隨著上樣液pH值的降低，回收率也逐漸提高，當樣液pH=3時，回收率達到90%，繼續(xù)降低pH值對回收率基本沒有影響。因此確定調(diào)節(jié)上柱液的pH≤3。在日常檢測中，如果每個樣品上清液都要調(diào)節(jié)pH值，不易實現(xiàn)批量操作。通過對多種復合預混料、維生素預混料和微量元素預混料綜合考察發(fā)現(xiàn)，500μL 10%磷酸水溶液均能將5 mL上清液的pH值調(diào)節(jié)到＜3。最后確定通過向5mL上清液中加入500μL 10%磷酸水溶液的方式調(diào)節(jié)樣液pH值后上柱凈化。

分析原因：不同飼料樣品經(jīng)過堿性的磷酸氫二鉀溶液提取后上清液的pH值在7～8，而洛克沙胂在堿性水溶液環(huán)境下目標物帶負電，不易在固相萃取柱中保留下來。調(diào)節(jié)上清液的pH值小于pKa值，洛克沙胂帶正電，目標物能在固相萃取柱上有效保留。

2.5 飼料中洛克沙胂檢測的工作曲線、相關系數(shù)（r）、檢測限（LOD）

洛克沙胂在0.5～20.0μg/mL范圍內(nèi)線性良好，工作曲線及相關參數(shù)見表3。

表3 飼料中洛克沙胂檢測的線性方程，相關系數(shù)（R2）、檢出限和定量限

2.6 回收率和精密度

預混合飼料中洛克沙胂測定的回收率和日間與日內(nèi)精密度見表4。實驗結(jié)果表明，在三種飼料基質(zhì)中，低、中、高3個添加水平的回收率在85.9%～93.4%。日內(nèi)測定的RSDintra（n=6）在3.6%～7.6%，日間測定的RSDinter（n=3）在4.3%～8.6%。

表4 回收率和日內(nèi)、日間標準偏差

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了預混合飼料中洛克沙胂的測定方法，以磷酸氫二鉀溶液為提取液，上清液經(jīng)10%磷酸水溶液調(diào)節(jié)pH后上MAX小柱凈化，吹干后以含有0.1%甲酸的10%甲醇水溶液復溶后上機檢測，優(yōu)化后的方法精密度高，回收率好。相對于原方法，增加了調(diào)節(jié)上柱液pH值的過程，并且改變了洗脫液的配比，在回收率和精密度上都有了極大的提高，基本能夠完全滿足日常檢測的需求。

洛克沙胂禁用之后，對檢測的靈敏度有更高的要求，下一步我們將基于目前的樣品前處理方法，開發(fā)適用于洛克沙胂測定的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法。

參考文獻：（略）