枯草芽孢桿菌抑菌強度比較試驗研究

◆作者：周淑貞辜質純李成應 謝志恒 張瑞雪顧萬軍 黃良宗

◆單位：1佛山市南海東方澳龍制藥有限公司；2佛山科學技術學院生命科學與工程學院

抗生素在人類與動物疾病治療過程中發(fā)揮了巨大貢獻。然而，抗生素的過度使用，使得病原細菌對抗生素的耐藥性越來越強，對人類健康造成嚴重威脅（龔發(fā)源等，2018）。這就迫使人們尋找新的抗菌藥物。在尋找過程中，人們逐漸把目光投向了抗菌肽。抗菌肽（antimicrobial peptide,AMP）是宿主先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有抗菌（細菌和真菌）、抗病毒、抗寄生蟲、免疫調節(jié)、中和內毒素等多種生物學活性（李杰等，2019；譚鳳霞等，2020）。

AMP是一類存在于大多數生物體內的兩親性、帶正電的小分子多肽，具有廣譜抗菌活性（譚鳳霞等，2020）。根據肽鏈的結構特征可將抗菌肽分為兩類：一種是富含半胱氨酸呈螺旋狀的開放性的線形肽；另一種是自身連接成環(huán)的環(huán)形肽，且這兩種肽鏈結構通過與?；B接的脂肪酸形成脂肽（Meena等，2015）。由環(huán)形肽和脂肪酸組成的脂肽，具有抗菌譜廣、作用迅速強大、不易產生耐藥性等優(yōu)點，在醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)中具有廣闊的應用前景（毛雯等，2018；魏長浩等，2018）。

芽孢桿菌能夠產生多種具有較廣抗菌譜的活性物質，這些抗菌物質大多屬于多肽類。芽孢桿菌產生的抗菌肽具有抑制霉菌等真菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌的生物活性，部分還具有抗病毒和抗支原體的特性（龔發(fā)源等，2018）。芽孢桿菌可以產生多種抗菌物質，主要包括表面活性素（surfactins）、伊枯草菌素類（iturins）、豐原素類（fengycins）等脂肽類抗生素（朱洪磊等，2020；喬曉妮等，2020）。

本文作者從不同環(huán)境和益生素產品中分離鑒定16株枯草芽孢桿菌，應用濾紙片方法進行芽孢桿菌抑菌性的比較試驗，篩選抑菌性較強的菌株，為益生素應用和芽孢桿菌抗菌肽研究的候選菌株奠定基礎。

1 試驗材料和方法

1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/L）瓊脂：葡萄糖10g，酵母粉g5，NaCl 10g，蛋白胨10g，瓊脂17g（固體培養(yǎng)基添加），去離子水定容至1L，調pH 7.0，121℃，20min滅菌，備用。

1.2 指示菌

大腸桿菌（K12D31）：金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 試驗菌株

試驗分離枯草桿菌菌株及來源見表1。試驗分離枯草桿菌菌株通過對16SrDNA基因片段測序，并與基因BANK數據庫進行序列同源性比較，鑒定證明試驗分離枯草桿菌菌株均為枯草桿菌。

表1 試驗分離枯草桿菌菌株序號及來源

1.4 細菌培養(yǎng)

1.4.1 指示菌培養(yǎng)

將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種于LB培養(yǎng)基，37℃，振搖（120r/min）培養(yǎng)16～24 h，細菌濃度約為OD1.0（600 nm）左右，取出，置4℃，備用。

1.4.2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)

將備試株枯草芽孢桿菌應用普通瓊脂平板分離培養(yǎng)，挑取典型菌落，接種于LB培養(yǎng)基，37℃，振搖（120r/min）培養(yǎng)24 h，取出菌液，置4℃，備用。

1.5 抑菌試驗

1.5.1 指示菌抑菌平板制備

取熔化后冷至50～56℃LB瓊脂，取指示菌液，加每平皿約20μL，澆注平板，風干表面凝集水，備用。

1.5.2 紙片抑菌法

取出待測枯草芽孢桿菌菌液，用濾紙片（直徑6 mm，121℃，20 min，干燥備用）蘸取被測菌液（約15～20μL），貼附指示菌平皿表面，以培養(yǎng)基作對照，每株菌做3皿次重復，置37℃，18～24 h取出，用游標卡尺計量抑菌圈直徑（mm），記錄結果。

1.5.3 結果判定

參照藥物敏感性判定標準，判定抑菌強度。即抑菌圈直徑（mm），0判定為“-”；10以下為“+”；10～14為“++”；15～20為“+++”；20以上為“++++”。

2 結果與討論

2.1 試驗分離枯草芽孢桿菌菌株抑菌性

圖1中抑菌比較試驗結果表明：枯草芽孢桿菌04、07、13、16號菌株的抑菌強度在“+++”以上，結合對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌強度，認為上述4株枯草芽孢桿菌菌株可以作為益生菌添加劑或抗菌肽研發(fā)的候選菌株，開展進一步的試驗應用研究工作。

表2 枯草芽孢桿菌16株抑菌性比較分析表

圖1 芽孢桿菌抑菌試驗

3 討論

枯草芽孢桿菌作為益生菌飼料添加劑已納入到農業(yè)部飼用益生菌名錄，并得到廣泛應用。很多的益生菌飼料添加劑生產應用以及對枯草芽孢桿菌的進一步應用研究認為，枯草芽孢桿菌的不同菌株抑菌強度是不同的，本試驗對不同來源的分離菌株的抑菌試驗篩選比較也證明了這一觀點。

芽孢桿菌的抑菌作用強度主要取決于產生抗菌肽的性質和產生量。芽孢桿菌海陸共棲，是一類公認的細菌素產生菌。來源于芽孢桿菌的抗菌肽，因其廣譜抗菌能力以及較為高效的活性而備受關注。本試驗通過培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基篩選或單菌株多次級代謝產物策略（OSMAC策略）比較篩選出的4株枯草芽孢桿菌所產生的抗菌肽具有抑菌性，但是抗菌肽產量的提高有待于進一步研究。

參考文獻：（略）