殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架材料對滑膜間充質(zhì)干細胞成軟骨能力的實驗研究

耿嵐，黃海波，孟繁華，房尚華

(1. 北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518034；2.深圳市人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 深圳 518020)

0 引言

組織生物工程中細胞支架占據(jù)很重要的位置，其能夠為細胞的增殖分化以及組織的形成提供合適的三維空間[1]。目前軟骨組織工程支架的應(yīng)用中主要分為人工合成支架以及天然支架，其中人工合成支架的材料有聚乙醇酸和聚乳酸以及兩者進行結(jié)合的聚合物[2]。天然支架材料主要有膠原以及殼聚糖等。人工合成的支架具有操作容易以及相對較好的機械性能等優(yōu)點，但是其對于細胞基質(zhì)的產(chǎn)生不利。相比較而言，天然材料來源主要為動物或者是人，其能夠降解、無毒并且具有很好的生物相容性，能夠促進細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生并且對細胞的黏附有利，故而，天然支架材料受到了廣泛的關(guān)注[3]。殼聚糖廣泛存在于自然界之中，其具有很好的生物相容性并且可降解，故而在細胞支架中應(yīng)用廣泛[4]。Ⅰ型膠原由于其為多組織細胞外基質(zhì)成分，故而在細胞支架中應(yīng)用廣泛[5]。目前有不少殼聚糖Ⅰ型膠原復(fù)合支架的研究報導(dǎo)，但是關(guān)于殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架對滑膜間充質(zhì)干細胞成軟骨能力的研究較少，本研究探討殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架材料對滑膜間充質(zhì)干細胞成軟骨能力的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

MTT(Amresco)；殼聚糖(Sigma)；Ⅰ型膠原(Biosharp)；胎牛血清(Hyclone)、高糖DMEM(Gibco)；二酰熒光素(Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖I型膠原天然支架的制備

利用0.1M的醋酸溶液對殼聚糖以及Ⅰ型膠原進行溶解，配置1%以及0.5%的殼聚糖以及Ⅰ型膠原溶液，然后將殼聚糖以及Ⅰ型膠原按照體積比2∶3進行混合攪拌，之后過濾，將過濾得到的溶液加入48孔板中，沒空的體積為0.5mL.將之進行-70℃、-40℃、-20℃以及4℃的梯度冷凍，之后對其進行真空處理后冷凍干燥48h。同時配置2%的殼聚糖溶液以相同方法制備存殼聚糖支架作為對照組。

1.2.2 對支架材料的物理性能進行檢測

將制備的支架于樣品基臺進行黏附，使用二氧化碳臨界點對其進行干燥，真空條件下噴金鍍膜，使用掃描電鏡(Phenom LE，荷蘭)對支架的形態(tài)進行觀察，并利用Image Pro Plus 6.0軟件選取掃描電鏡中的孔隙，對其孔徑直徑進行記錄。利用乙醇置換法對制備的支架的孔隙率進行檢測。支架的吸水率的檢測：將干重條件下的支架重量記為m1，然后將支架浸潤在蒸餾水中，支架吸取蒸餾水飽和之后去除稱重記為m2，則其吸水率為(m2-m1)/m2×100%，對其吸水率反復(fù)測量五次之后取其平均值則為支架最終的吸水率。

1.2.3 滑膜細胞的培養(yǎng)以及擴增

將SD大鼠進行稱重之后，對其進行麻醉，待其起效之后，將其從大鼠的膝關(guān)節(jié)正中皮膚中間切開，對其組織進行分離直到滑膜處，然后切取滑膜組織放入EP管中，使用0.4%的Ⅰ型膠原酶對滑膜組織進行消化，然后放搖床以200rpm/min的條件振搖4h。然后將之取出對細胞進行離心過濾，將收集到的細胞使用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，接種密度為2×105個/cm2，于37℃以及5%CO2條件下進行培養(yǎng)。等待細胞鋪滿培養(yǎng)皿80%左右進行傳代，接種比例為1∶4到1∶3，使用培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基，將之傳代到3代后待應(yīng)用于后續(xù)研究。

1.2.4 滑膜間充質(zhì)干細胞-殼聚糖I型膠原復(fù)合培養(yǎng)以及細胞黏附的檢測

使用無菌濾紙吸干高糖DMEM浸潤的支架用于后續(xù)研究，將傳代至第三代的滑膜間充質(zhì)干細胞使用胰酶進行消化之后，將其密度進行調(diào)整，具體為6×106個/mL。支架置于24孔板中，然后向支架表面加入細胞懸液100μL，放置于培養(yǎng)箱中進行3h的培養(yǎng)，再將支架進行翻轉(zhuǎn)之后，同樣加入細胞懸液100μL于其表面，繼續(xù)進行3h的培養(yǎng)之后向其中加入1.5mL高糖DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)。細胞支架復(fù)合物進行24h的培養(yǎng)之后，使用胰酶對其進行消化，將未黏附于支架的細胞懸浮并利用Vi-cell對其計數(shù)，計算細胞黏附率。細胞支架復(fù)合物培養(yǎng)48h之后使用二乙酰熒光素對支架上活細胞進行標記。其中二乙酰熒光素的濃度未15μg/mL，其溶劑為二甲基亞砜。然后將標記大的復(fù)合物加入培養(yǎng)液孵育15min之后，使用PBS對其進行漂洗，洗凈二乙酰熒光素，然后將復(fù)合物于共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

1.2.5 噻唑藍檢測

將制備好的殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架以及純殼聚糖支架材料各選擇12塊放入24孔板中，然后將細胞支架以1.5×105cell/支架的密度接種于支架的表面，同時設(shè)置12個空白對照，接種密度相同，在對其接種3h后，向孔板中加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在對其培養(yǎng)的過程中每兩天進行1次換液。在培養(yǎng)到第1、3、5以及7天時進行檢測，并且每個時間點選取3個支架材料。使用酶標儀測量其吸光度值，選取的波長為570nm。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支架的材料的形態(tài)學(xué)特點

對制備的支架進行觀察，支架呈現(xiàn)圓柱狀，并且具有彈性，質(zhì)地均一的特點。通過掃描電鏡對殼聚糖Ⅰ型膠原以及純殼聚糖支架進行觀察，其表面以及縱剖面均呈現(xiàn)為蜂窩狀并且孔隙相連，其孔隙分布為六邊形，且具有孔壁厚度一致的特點，具體見圖1、2。

圖1 殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架材料掃描電鏡圖像(×200)

圖2 純殼聚糖支架材料掃描電鏡圖片(×200)

2.2 支架材料的物理性能

殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架于純殼聚糖支架材料在孔徑以及孔隙率之間對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但是殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架材料相比較純殼聚糖支架材料其吸水率明顯更高(P＜0.05)，具體見表1。

表1 殼聚糖Ⅰ型膠原以及純殼聚糖支架材料物理性能檢測結(jié)果(±s)

表1 殼聚糖Ⅰ型膠原以及純殼聚糖支架材料物理性能檢測結(jié)果(±s)

支架材料 孔隙率(%) 孔徑(μm) 吸水率(%)殼聚糖Ⅰ型膠原91.44±1.38 118.54±39.02 70.21±5.78殼聚糖 91.39±0.59 109.69±34.98 52.39±1.47 t 0.163 0.827 14.638 P 0.871 0.412 0.000

2.3 支架材料對滑膜間充質(zhì)干細胞的黏附以及增殖的影響

對殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架材料細胞的黏附率進行檢測結(jié)果為96.49%，對純殼聚糖支架材料細胞黏附率檢測結(jié)果為92.14%，兩者對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對殼聚糖Ⅰ型膠原支架材料中的滑膜間充質(zhì)干細胞生長狀況進行檢測，其培養(yǎng)48h后形狀為梭形，并且在支架材料的全層均有分布，具體如圖3。利用MTT法對支架材料對細胞增殖影響進行檢測，結(jié)果顯示培養(yǎng)第1天，兩組材料對細胞增殖無影響。培養(yǎng)第3到7天，兩組之間對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；殼聚糖Ⅰ型膠原以及純殼聚糖材料均對細胞增殖具有促進作用，但是殼聚糖Ⅰ型膠原支架材料的促進作用更為明顯。

圖3 滑膜間充質(zhì)干細胞在支架中生長情況

3 討論

使用組織工程復(fù)合物對患者的軟骨組織進行修復(fù)有很多潛在的好處，首先，細胞能夠在支架上進行預(yù)分化；其次，可以減少人體的損傷，利用關(guān)節(jié)鏡等技術(shù)將支架放入軟骨的缺損處，減少患者的二次損傷[6]。細胞支架能夠為患者提供一個穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，能夠促進軟骨的物質(zhì)交換以及生長代謝，在軟骨修復(fù)過程中對組織形成具有引導(dǎo)作用[7]。目前使用的支架材料主要有天然支架材料以及人工合成支架材料，而使用人工合成的支架材料由于具有親水性差，不利于細胞的吸附并且易引起患者炎性反應(yīng)等缺點，故而應(yīng)用偏少[8]。本研究探討殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架對滑膜間充質(zhì)干細胞成軟骨能力研究。

本研究結(jié)果顯示通過掃描電鏡對殼聚糖Ⅰ型膠原以及純殼聚糖支架進行觀察，其表面以及縱剖面均呈現(xiàn)為蜂窩狀并且孔隙相連，其孔隙分布為六邊形，且具有孔壁厚度一致的特點，為細胞的黏附提供了有利的條件。同時吸水率提高更能保護患者軟骨的微環(huán)境，更有利于細胞的生長[9]。對支架的物理性能進行探究，結(jié)果顯示殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架于純殼聚糖支架材料在孔徑以及孔隙率之間對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但是殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架材料相比較純殼聚糖支架材料其吸水率明顯更高(P＜0.05)，說明使用殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架材料效果更好，其具有更好的吸水性，為軟骨的物質(zhì)交換以及生長代謝提供了有利的條件。對滑膜間充質(zhì)干細胞黏附以及增殖影響進行研究結(jié)果顯示，殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架材料細胞的黏附率進行檢測結(jié)果為96.49%，對純殼聚糖支架材料細胞黏附率檢測結(jié)果為92.14%，兩者對比無統(tǒng)計學(xué)差異。對殼聚糖Ⅰ型膠原支架材料中的滑膜間充質(zhì)干細胞生長狀況進行檢測，其培養(yǎng)48h后形狀為梭形，并且在支架材料的全層均有分布。利用MTT法對支架材料對細胞增殖影響進行檢測，結(jié)果顯示培養(yǎng)第1天，兩組材料對細胞增殖無影響。培養(yǎng)第3到7天，兩組之間對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；殼聚糖Ⅰ型膠原以及純殼聚糖材料均對細胞增殖具有促進作用，但是殼聚糖Ⅰ型膠原支架材料的促進作用更為明顯。這也表明殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架更利于細胞的黏附以及增殖，為細胞的增殖以及分化提供更好的環(huán)境。

綜上所述，殼聚糖Ⅰ型膠原天然支架能夠為滑膜間充質(zhì)干細胞的生長以及分化和組織的形成提供很好的環(huán)境，在軟骨組織工程支架領(lǐng)域發(fā)展前景廣泛。