雪茄煙葉原料發(fā)酵微生物多樣性及酶活變化研究

張磊,羅澤華,楊明川,李世貴,辛玉華,蔡斌,劉好寶,曾代龍,顧金剛*,段碧華

(1.中國煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克?海口 570105;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081;3.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院,北京 102206;4.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司長城雪茄煙廠,四川 什邡 618400)

中國的雪茄目前已進(jìn)入起步階段[1]。調(diào)制和發(fā)酵是雪茄煙葉質(zhì)量形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]，在一定溫度和濕度條件下，煙葉發(fā)酵理化特性和微生物種群會發(fā)生變化，激發(fā)煙葉內(nèi)的香氣物質(zhì)，改善雪茄的品質(zhì)[3]和青雜氣和苦澀等氣味，促使產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味和芳香并提高燃燒性能[4]。雪茄煙葉發(fā)酵有自然發(fā)酵和人工發(fā)酵兩種方式[5]。

在微生物和環(huán)境的協(xié)同作用下，煙葉會發(fā)生一系列生化反應(yīng)[6]。在發(fā)酵過程中，微生物的群落多樣性和豐度呈動態(tài)變化，產(chǎn)生多種水解酶，如蛋白酶、果膠酶、淀粉酶等，微生物的活動主導(dǎo)物質(zhì)降解與轉(zhuǎn)化。微生物與酶類協(xié)同作用，將煙葉中的碳水化合物和蛋白質(zhì)物質(zhì)充分轉(zhuǎn)化生成一系列小分子化合物[7-12]。姚光明等[13]研究發(fā)現(xiàn)，中性蛋白酶對煙葉中蛋白質(zhì)降解作用明顯，燃吸品質(zhì)得到明顯改善；閻克玉等[14]分析發(fā)現(xiàn)，在煙葉發(fā)酵中添加果膠酶可降解細(xì)胞壁物質(zhì)；韓富根等[15]在測定煙草多酚氧化酶酶活性時發(fā)現(xiàn)，pH為堿性條件下酶敏感，在偏堿情況下酶活性下降很快。關(guān)亮等[16]在不同pH緩沖液條件下試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH為8時酶活性達(dá)到最大，pH繼續(xù)升高到9時酶活則活性下降。

本文對兩個品種的雪茄煙葉原料在不同發(fā)酵階段的微生物種群動態(tài)以及酶活特征進(jìn)行研究，以期為雪茄煙葉原料發(fā)酵工藝提供理論基礎(chǔ)與應(yīng)用參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試雪茄茄芯煙葉為海南不同種植地的古巴品種(樣品1)和印度尼西亞品種(樣品2)，初始水分含量25%，發(fā)酵溫度42～45℃，于發(fā)酵起始期(0 d)、發(fā)酵中期(45 d)和發(fā)酵結(jié)束期(90 d)隨機(jī)選取3把煙葉，每把煙葉中隨機(jī)抽取10片，置于自封袋中并保存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1樣品均質(zhì)化 煙葉去筋脈后與研磨球一起裝入不銹鋼研磨罐中，液氮處理10 min，用研磨儀(60 Hz，90 s)研磨。均質(zhì)儀(100 mL)中加入0.5 g煙葉粉末和40 mL PBS緩沖液(pH 7.2)充分研磨，4 ℃、3 500 r·min-1離心20 min，獲得上清液即為煙葉粗酶液。

1.2.2微生物高通量測序 采用細(xì)菌和真菌基因組提取試劑盒(D3350-02，Omega；D2300-100T，Solarbio)提取煙葉樣品中的微生物DNA并純化。以細(xì)菌和真菌DNA為模板，分別以引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/1492R(5′-GGT-TACCTTGTTACGACTT-3′)和ITS1(5′-CGTAG-GTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTAT-TGATATGC-3′)對細(xì)菌的16S rRNA V3和V4可變區(qū)和真菌ITS1區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。以1.0%瓊脂凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并基于IlluminaHiseq進(jìn)行測序(百邁客生物科技有限公司)。以QIME軟件以及R軟件等進(jìn)行生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3酶活測定 采用福林法和3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定蛋白酶、淀粉酶和果膠酶活性[17-20]。酶活反應(yīng)體系(1 mL)包括100 μL煙葉粗酶液和900 μL底物緩沖液。蛋白酶活性測定的底物緩沖液為酪蛋白溶液(pH 7.5)，40 ℃反應(yīng)20 min，用多功能微孔板酶標(biāo)儀(Infinite 200 PRO)測定680 nm吸光值，并基于L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。淀粉酶活性測定的底物緩沖液為淀粉溶液(pH 5.6)，40 ℃反應(yīng)30 min后加入1.5 mL DNS，測定520 nm吸光值，基于葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。果膠酶的底物緩沖液pH為4.8，48 ℃反應(yīng)30 min，測定540 nm吸光值，并基于以D-半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。

1.2.4pH測定 用pH 4.01和 6.86的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校準(zhǔn)pH計(jì)(梅特勒FE 28臺式酸度計(jì))。取一定量的煙葉粉末在40 ℃條件下干燥并過40目篩[21]，稱取2 g置于50 mL離心管中，加入20 mL蒸餾水后密封。20 ℃、200 r·min-1條件下震蕩30 min，靜置1 h后測定上清液的pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果及α-多樣性分析

通過HiSeq高通量測序從12個煙葉樣品中共獲得842 616條有效序列，代表1 879個OTU，且真菌種類較細(xì)菌更豐富(表1)。樣品1的細(xì)菌OTU數(shù)量在發(fā)酵起始為170個，發(fā)酵中期51個，發(fā)酵結(jié)束116個，呈先下降后上升的趨勢；相應(yīng)的ACE指數(shù)在發(fā)酵起始為178.40，發(fā)酵中期59.46，發(fā)酵結(jié)束143.66和Chao1指數(shù)發(fā)酵初期178.5，發(fā)酵中期57.0，發(fā)酵結(jié)束133.4，呈相同變化趨勢；但香農(nóng)指數(shù)由發(fā)酵初期的0.68到發(fā)酵結(jié)束2.32呈上升趨勢；辛普森指數(shù)由發(fā)酵初期0.82到發(fā)酵結(jié)束階段的0.14，呈下降趨勢。真菌OTU數(shù)量、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和辛普森指數(shù)由發(fā)酵初期361個和391.18、386.6、0.82到發(fā)酵結(jié)束階段187個和189.98、192.10.21，都呈持續(xù)下降趨勢。

表1 雪茄煙葉發(fā)酵樣品的微生物多樣性分析Table 1 Microbial diversity analysis oftobacco leaves of two cultivars

樣品2的細(xì)菌和真菌OTU的數(shù)量低于樣品1，但菌群變化規(guī)律與樣品1基本一致。在發(fā)酵初期階段兩種煙葉樣品微生物種類較為豐富，隨著發(fā)酵時間的延長菌群呈特異化和專一化。

2.2 雪茄煙葉樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu) 不同發(fā)酵時期雪茄煙葉樣品中的微生物群落會發(fā)生變化(圖1)。樣品1在發(fā)酵起始和中期的優(yōu)勢細(xì)菌為葡萄球菌(Staphylococcus)，而發(fā)酵結(jié)束時的菌群相對豐富，優(yōu)勢菌主要為腸桿菌屬(Enterobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、短桿菌屬(Brevibacterium)、葡萄球菌等。樣品2的微生物群落結(jié)構(gòu)與樣品1 既有共性也有差異，樣品2在三個發(fā)酵階段的優(yōu)勢細(xì)菌都是葡萄球菌，此外發(fā)酵初期和結(jié)束的優(yōu)勢菌還有棒狀桿菌(Corynebacterium)、四聯(lián)球菌(Tetragenococcus)和腸道球菌(Enteractinococcus)，中期的優(yōu)勢菌還有棒狀桿菌屬。

圖1 不同發(fā)酵時期雪茄煙葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Bacterial community structure of tobacco leaves at different fermentation stage

2.2.2真菌微生物群落結(jié)構(gòu) 從圖2可以看出，不同發(fā)酵時期樣品1中的真菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯區(qū)別，枝孢菌(Cladosporium)和曲霉(Aspergillus)在不同發(fā)酵階段都是優(yōu)勢菌，但豐度不同。在發(fā)酵結(jié)束后雪茄煙葉的細(xì)菌和真菌群落更多元化。真菌群落結(jié)構(gòu)分析表明，樣品2發(fā)酵起始的優(yōu)勢菌為未知真菌，在發(fā)酵中期優(yōu)勢菌變?yōu)榍购推渌?，結(jié)束時優(yōu)勢真菌更加豐富，包括枝孢菌、曲霉、赤霉菌(Gibberella)等。

圖2 不同發(fā)酵時期雪茄煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Fungal community structure of tobacco leaves at different fermentation stage

2.3 不同發(fā)酵時期雪茄煙葉樣品間基于微生物種群的聚類分析

2.3.1細(xì)菌微生物種群的聚類分析 從圖3可以看出，雪茄煙葉樣品1在發(fā)酵起始與中期兩個階段的微生物類群相似度較高，與發(fā)酵結(jié)束階段的差距較大。發(fā)酵起始與中期豐度較低且相似的細(xì)菌屬有10個，而發(fā)酵結(jié)束階段豐度高屬較多。樣品2的發(fā)酵起始和結(jié)束兩個階段的微生物類群相似度較高，與中期有一定的距離。發(fā)酵起始與結(jié)束豐度較低且相似的屬有4個，每個階段豐度較高的屬均有5個，通過熱圖分析發(fā)現(xiàn)雪茄樣品隨著發(fā)酵時間增加，物種更加多樣，樣品1在發(fā)酵結(jié)束這一階段物種更為多樣。

圖3 雪茄煙葉在發(fā)酵過程中的真菌多樣性聚類分析Fig.3 Cluster analysis of the fungal diversity of tobacco

2.3.2真菌微生物種群的聚類分析 真菌多樣性聚類分析結(jié)果與細(xì)菌不同。從圖4可以看出，雪茄煙葉樣品1在發(fā)酵起始與發(fā)酵中期微生物種群相似度較高聚為一類，與發(fā)酵中期差異較大。發(fā)酵前期、發(fā)酵結(jié)束具有相似豐度較低的真菌屬，在發(fā)酵中期階段度較高真菌屬有12個，種群較為豐富。樣品2在發(fā)酵前期與發(fā)酵中期微生物種群聚為一類，與發(fā)酵結(jié)束有一定的差異性。發(fā)酵前期、發(fā)酵中期有豐度較低且相似的真菌屬但較少，三個發(fā)酵階段中豐度較高的真菌屬數(shù)量均有5個。

圖4 雪茄煙葉在發(fā)酵過程中的真菌多樣性聚類分析Fig.4 Cluster analysis of the fungal diversity of tobacco

2.4 不同發(fā)酵時期雪茄煙葉樣品微生物物種分析

2.4.1細(xì)菌物種分析 從圖5可以看出，樣品1在發(fā)酵起始、中期、結(jié)束三個階段樣品共有的細(xì)菌OTU數(shù)量為27個，特有的細(xì)菌OTU數(shù)量分別為55、3、14個。發(fā)酵中期與結(jié)束兩階段的OTU數(shù)量較發(fā)酵起始有明顯的下降。不同階段樣品所含的細(xì)菌OTU數(shù)量依序?yàn)榘l(fā)酵起始>發(fā)酵結(jié)束>發(fā)酵中期。與樣品1 相比，樣品2 的細(xì)菌OTU較少。三個發(fā)酵階段的煙葉樣品細(xì)菌OTU 24個，但特有細(xì)菌OTU隨著發(fā)酵時間增加而不斷減少。

圖5 雪茄煙葉細(xì)菌物種Venn圖Fig.5 Venn map of bacterial species in tobacco leaf

2.4.2真菌物種分析 從圖6可以看出，樣品1在每個發(fā)酵階段的特有真菌OTU數(shù)量較多，分別為71、48、38個。三個發(fā)酵階段共有的真菌OTU為76個，不同階段樣品所含的真菌OTU數(shù)量依序?yàn)榘l(fā)酵起始>發(fā)酵中期>發(fā)酵結(jié)束。而樣品2的真菌OTU較為豐富，共有的真菌OTU為81個。在發(fā)酵起始階段特有的真菌OTU高達(dá)136個，是整個發(fā)酵時期真菌OTU最為豐富的一個階段。隨著發(fā)酵時間增加真菌OTU不斷減少，中期104個OTU，結(jié)束時只有46個。

圖6 雪茄煙葉真菌物種Venn圖Fig.6 Venn map of fungal species in tobacco leaf

2.5 不同發(fā)酵時期酶活變化規(guī)律研究

雪茄煙葉不同發(fā)酵時期酶活變化規(guī)律如圖7所示。可以看出，樣品1蛋白酶活性在發(fā)酵起始階段為129.89 U·g-1，在發(fā)酵中期降低，而發(fā)酵結(jié)束后活性升高至165.95 U·g-1。果膠酶活性隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸降低，發(fā)酵結(jié)束時為0.95 U·g-1。淀粉酶活性在整個發(fā)酵過程中變化不大(0.29～0.34 U·g-1)，不同階段間差異不顯著。樣品2的酶活和變化趨勢與樣品1 有顯著差異。發(fā)酵起始的蛋白酶活性較低(26.50 U·g-1)，隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白酶活性也在增加，發(fā)酵結(jié)束時蛋白酶活性已高達(dá)121.57 U·g-1。果膠酶活性呈現(xiàn)一個先上升再下降的趨勢，在發(fā)酵中期果膠酶活性高達(dá)1.60 U·g-1，而發(fā)酵起始與結(jié)束后的果膠酶活性相差較小。淀粉酶活性在發(fā)酵中期酶活最高(0.38 U·g-1)，發(fā)酵結(jié)束后淀粉酶活性比發(fā)酵起始的酶活還要低。

圖7 雪茄煙葉的蛋白酶、果膠酶和淀粉酶在發(fā)酵期間的活性變化Fig.7 Changes of protease,pectinase and amylase activities in cigar tobacco leaf

2.6 雪茄煙葉發(fā)酵過程中pH的變化

雪茄煙葉兩個樣品在發(fā)酵過程中pH的變化差異很大(圖8)。樣品1的pH在發(fā)酵中期階段pH達(dá)到7.6，呈堿性狀態(tài)，而發(fā)酵起始與結(jié)束時pH都在酸性范圍內(nèi)且差異較小。樣品2的pH在發(fā)酵過程中都呈酸性狀態(tài)，且差異較小(圖8)。

圖8 雪茄煙葉的pH變化Fig.8 pH changes of the cigar tobacco leaf

3 討論

兩種雪茄煙葉樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)在發(fā)酵的三個階段有顯著差異。樣品1在整個發(fā)酵過程中細(xì)菌數(shù)量一直呈現(xiàn)下降趨勢，這與杜佳等[10]對雪茄茄衣人工發(fā)酵過程中葉面微生物區(qū)系研究結(jié)果一致。張曉娟等[7]在相對濕度70%、溫度40 ℃條件下對雪茄外包皮煙發(fā)酵發(fā)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量占絕對優(yōu)勢，未分離到酵母和放線菌。李寧等[22]對雪茄煙葉表面微生物分離鑒定發(fā)現(xiàn)，人工發(fā)酵后的雪茄煙葉表面微生物數(shù)量急劇減少，細(xì)菌數(shù)量仍占絕對優(yōu)勢，芽孢桿菌屬和青霉屬在發(fā)酵前后均處于優(yōu)勢地位。張鴿等[23]分析了4個國家雪茄外包皮煙葉表面細(xì)菌種類，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬為主要優(yōu)勢菌。本研究結(jié)果表明，待測雪茄煙葉樣品中細(xì)菌以葡萄球菌屬為主，微生物多樣性豐度與種類與已有研究存在差異性，可能與樣品本身和發(fā)酵環(huán)境條件有關(guān)[24-26]。

酶活指標(biāo)在雪茄煙葉發(fā)酵過程中作用明顯。樣品1蛋白酶活(165.95 U·g-1)和淀粉酶活(0.34 U·g-1)在發(fā)酵結(jié)束時期最高，果膠酶活性(1.30 U·g-1)在發(fā)酵起始時期呈最高。樣品2蛋白酶活(121.57 U·g-1)在發(fā)酵結(jié)束時期最高；果膠酶活性(1.60 U·g-1)和淀粉酶活性(0.38 U·g-1)在發(fā)酵中期活性最高。在煙葉發(fā)酵過程中不光有微生物、化學(xué)反應(yīng)的協(xié)同作用，酶在整個發(fā)酵過程中起著促進(jìn)作用[27]。閆克玉等[28]使用混合酶制劑來提高上部煙葉品質(zhì)研究結(jié)果表明，α-淀粉酶用量10 mL·kg-1處理后的煙葉總氮含量減少、總糖含量增加，雜氣較少吸味更加醇和；蛋白酶用量80 U·g-1處理的煙葉蛋白質(zhì)含量減少，總糖含量增加，余味變得柔軟干凈。黃強(qiáng)等[29]采用先進(jìn)的固定化酶反應(yīng)技術(shù)，與α-淀粉酶的催化作用來對煙葉進(jìn)行保潤功效。王懷珠等[30]在烤煙中烘烤過程中外源添加淀粉類酶，酶量增加導(dǎo)致淀粉含量下降，水溶性糖和還原糖含量增加。

雪茄煙葉發(fā)酵過程中pH會發(fā)生變化。樣品1雪茄原料在發(fā)酵中期pH呈堿性，三個不同發(fā)酵階段pH變化較為明顯；樣品2雪茄原料在不同發(fā)酵階段pH變化較小，呈酸性狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)酶活的變化與pH有著密切聯(lián)系，蛋白酶的酶活在酸性條件下隨pH的升高而逐漸上升，在堿性條件下隨pH的升高迅速下降，這一研究結(jié)果與王朋朋等[19]研究結(jié)果一致。細(xì)菌中優(yōu)勢菌的變化影響著果膠酶活性的變化[31-32]。