超臨界流體色譜分析苯菌靈準(zhǔn)確含量的可行性探索

田茂英，萬宏劍，唐麗莉，郭 天，楊新磊*

（1.山東濰坊潤豐化工股份有限公司，山東濰坊262737；2.江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司，南京210046；3.安捷倫科技（中國）有限公司，上海200080）

苯菌靈具有高效、廣譜、內(nèi)吸和低毒等特性，對殺菌和殺螨卵作用良好，在植物體內(nèi)代謝為多菌靈及具有揮發(fā)性的異氰酸丁酯[1]。異氰丁酸酯易與葉果表皮的角質(zhì)層、蠟質(zhì)層結(jié)合，所以藥效常優(yōu)于多菌靈。目前國內(nèi)登記注冊的苯菌靈原藥和劑型廠家約有15家，每年的產(chǎn)量約為1 000 t[2]。

苯菌靈為白色結(jié)晶固體，在常溫下固體狀態(tài)穩(wěn)定，但是在水溶液及常規(guī)有機(jī)溶劑中易降解為多菌靈。這對于苯菌靈原藥或可濕性粉劑的質(zhì)量控制造成極大的困難。目前關(guān)于苯菌靈的分析方法有液相色譜法[3-8]、分光光度法[9]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[11-12]等。液質(zhì)聯(lián)用法多用于瓜果蔬菜和環(huán)境水樣的殘留。對于產(chǎn)品質(zhì)量控制，大多企業(yè)采用高效液相色譜方法。其中，間接方法是先將苯菌靈降解成多菌靈，通過測定多菌靈的含量來反推算出苯菌靈的結(jié)果。這種方式需要考察苯菌靈的轉(zhuǎn)化速率，必須完全轉(zhuǎn)化才能保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，然而產(chǎn)品本身存在的多菌靈也會(huì)對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。另外一種方法是直接測定法，該法必須保證苯菌靈溶液的穩(wěn)定性，采用的是在苯菌靈溶液中加入一定量的異氰酸丁酯抑制苯菌靈的降解[6]，但異氰酸丁酯具有與多菌靈反應(yīng)生成苯菌靈的可能性，造成苯菌靈測定結(jié)果偏高[4]。

超臨界流體色譜（SFC）是近年重獲新生的一種綠色分析技術(shù)，主要利用超臨界二氧化碳流體為主要流動(dòng)相，加入一些改性劑和添加劑來完成不同類型化合物分析。SFC作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)液相和氣相的補(bǔ)充分析技術(shù)，已經(jīng)在食品、藥品、天然產(chǎn)物等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用[13-16]。相比于液相色譜，SFC對手性化合物、結(jié)構(gòu)類似物、易分解化合物和脂溶性化合物都顯示出了非常大的優(yōu)勢。筆者則利用防止待測物降解這一特點(diǎn)開發(fā)了一種簡單、快速、準(zhǔn)確的苯菌靈分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity II超臨界流體色譜系統(tǒng)，配置超臨界流體模塊、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器（含溫控模塊）、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Openlab CDS 2.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國安捷倫科技有限公司。Zorbax Rx-SIL不銹鋼色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國安捷倫科技有限公司；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器，美國Scientific Industries；ME204分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；KQ-250V超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

二氧化碳（鋼瓶氣，純度99.995%），液化空氣（中國）投資有限公司；乙腈、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯（色譜級），德國默克公司；二乙胺（色譜級），迪馬公司；0.45 μm尼龍濾膜，美國安捷倫公司；苯菌靈標(biāo)樣（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95.0%）、多菌靈標(biāo)樣（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%），山東濰坊潤豐化工股份有限公司；去離子水為Milli Q純水機(jī)新制。

1.2 SFC分析方法

筆者采用Zorbax Rx-SIL（4.6 mm×250 mm，5 μm）為分析柱，柱溫為30℃。二氧化碳為流動(dòng)相A；流動(dòng)相B為乙腈并加入0.2%二乙胺作為添加劑，采用梯度洗脫（表1）。流速為3 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL，采用乙腈為feed溶劑，速率為400 μL/min；自動(dòng)進(jìn)樣器溫控為10℃；檢測波長為290 nm（帶寬16 nm），參比波長為360 nm（帶寬80 nm）；系統(tǒng)反壓控制器壓力設(shè)置為150 bar；二氧化碳出口噴嘴溫度設(shè)定為60℃。

表1 梯度洗脫程序

1.3 樣品制備

稱取10.0 mg苯菌靈原藥，加入10 mL放置于4℃冰箱的二氯甲烷溶液后，渦旋1 min，取2 mL過0.45 μm尼龍濾膜（提前放置于4℃冰箱）至進(jìn)樣小瓶，2 h內(nèi)完成分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法

苯菌靈的不穩(wěn)定性導(dǎo)致質(zhì)量分析面臨很大挑戰(zhàn)。參考CIPAC方法，采用含3%（V/V）異氰酸正丁酯的乙腈溶液來萃取苯菌靈，利用異氰酸正丁酯來抑制苯菌靈的降解。實(shí)際分析中，苯菌靈仍有降解現(xiàn)象，如色譜圖1A顯示。多菌靈和苯菌靈色譜峰之間的基線明顯抬高，該現(xiàn)象是由于分析過程中的降解引起的。將3%（V/V）正丁基異氰酸酯乙腈溶液溫度降低到-15℃來溶解苯菌靈，現(xiàn)配后快速進(jìn)行液相色譜分析，柱溫設(shè)為5℃，較常溫狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，但苯菌靈在分析過程中仍有分解現(xiàn)象（圖1B）。結(jié)果表明，由于流動(dòng)相水的存在，采用高效液相色譜法會(huì)導(dǎo)致苯菌靈在分析過程中降解，不利于得到苯菌靈的準(zhǔn)確定量結(jié)果。

圖1 苯菌靈的HPLC分析色譜圖

2.2 采用SFC方法抑制苯菌靈降解

SFC采用超臨界狀態(tài)二氧化碳為主要流動(dòng)相，并使用有機(jī)溶劑作為改性劑，可以避免使用水溶液。這一特性有利于分析遇水易分解化合物。Liu等[17]利用SFC-QQQ準(zhǔn)確測定了銀杏內(nèi)酯及其降解產(chǎn)物，避免了銀杏內(nèi)酯在反相分析過程中的水解現(xiàn)象。筆者首先嘗試了甲醇作為改性劑來分析不同溶劑體系（甲醇、乙腈、四氫呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯）溶解的苯菌靈樣品，發(fā)現(xiàn)氯仿溶解的樣品，苯菌靈的百分含量最高，但是放大色譜圖后仍然可以發(fā)現(xiàn)基線抬高的現(xiàn)象，表明分析過程中的降解依然存在。為進(jìn)一步消除分析過程中的降解現(xiàn)象，將SFC改性劑由甲醇更換為乙腈。從色譜表現(xiàn)上看，樣品中苯菌靈色譜峰與多菌靈色譜峰之間的基線和空白基線吻合，沒有抬高跡象（圖2）。相比于甲醇，乙腈是一種非質(zhì)子化溶劑，更利于待測物的穩(wěn)定性。因此選擇乙腈為SFC方法的改性劑。

圖2 SFC分析苯菌靈原藥色譜圖

2.3 SFC添加劑的選擇

超臨界流體色譜分析常常需要在改性劑中加入一定量的酸、堿或有機(jī)鹽類來增加超臨界流體對化合物的溶劑能力并起到改善峰型的作用。當(dāng)乙腈中不添加任何改性劑時(shí)，苯菌靈色譜峰型對稱，多菌靈無法從色譜柱中洗脫下來。實(shí)驗(yàn)考察了三氟乙酸、氨水、二乙胺在不同濃度下對多菌靈的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)二乙胺添加后多菌靈峰型最好，其他有關(guān)雜質(zhì)分離效果最佳，因此選擇乙腈中二乙胺的添加量為0.2%（V/V）作為最終濃度。

2.4 樣品溶劑的選擇及穩(wěn)定性考察

根據(jù)2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將苯菌靈溶解在不同的有機(jī)溶劑中后立即進(jìn)樣。如圖3所示，在二氯甲烷溶液中得到的苯菌靈百分含量最高（96.3%），甲醇中的含量最低（78.3%）。雖然苯菌靈在二氯甲烷溶液中的含量最高，但仍無法確定3%左右的多菌靈雜質(zhì)是來源于產(chǎn)品本身還是在配制過程中的降解。筆者參考CIPAC方法，將苯菌靈原藥和多菌靈原藥分別溶解在含3%（V/V）異氰酸正丁酯的二氯甲烷溶液后采用SFC分析，結(jié)果表明苯菌靈樣品純度達(dá)到99.6%且未發(fā)現(xiàn)多菌靈峰存在，但多菌靈樣品溶液色譜圖中也未發(fā)現(xiàn)多菌靈峰，只有苯菌靈峰，說明異氰酸正丁酯已經(jīng)快速地將多菌靈反應(yīng)成苯菌靈。另一方面，用放置于4℃下的二氯甲烷和常溫下的二氯甲烷分別溶解苯菌靈后進(jìn)樣，結(jié)果并無明顯差異，但隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加，在自動(dòng)進(jìn)樣器不控溫情況下，常溫二氯甲烷溶解的苯菌靈降解速度明顯高于4℃溶解的樣品。為進(jìn)一步考察苯菌靈樣品連續(xù)分析的可行性，筆者采用4℃二氯甲烷溶液配制樣品后，放于10℃控溫的自動(dòng)進(jìn)樣器，每10 min進(jìn)樣一次，前2 h苯菌靈含量保持不變，隨后開始慢慢降低，表明樣品溶液可以穩(wěn)定放置2 h。

圖3 苯菌靈在不同有機(jī)溶劑溶解下的百分含量結(jié)果

2.5 重復(fù)性

考慮到企業(yè)QC實(shí)驗(yàn)室主要以面積歸一化方法來測定苯菌靈含量，所以筆者只考察了重復(fù)性結(jié)果。分別稱取3份苯菌靈原藥，按“1.3樣品制備”后放入自動(dòng)進(jìn)樣器，以“2.2 SFC分析方法”進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣2次，然后以每針結(jié)果中苯菌靈的百分含量和保留時(shí)間來考察方法穩(wěn)定性。結(jié)果顯示苯菌靈百分含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%（n=6），保留時(shí)間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%（n=6），表明該方法穩(wěn)定性良好，適合于苯菌靈原藥質(zhì)量的準(zhǔn)確控制。

3 結(jié) 論

苯菌靈作為一種光譜低毒殺菌劑，在國內(nèi)應(yīng)用廣泛，但是由于其溶液穩(wěn)定性極差，其質(zhì)量分析方法很難操作，結(jié)果誤差也較大。筆者首先利用超臨界流體色譜所用流動(dòng)相具有惰性、無水的特點(diǎn)，先從分析過程避免苯菌靈的降解，再考察了不同有機(jī)溶劑溶解后苯菌靈的穩(wěn)定性，最終建立了苯菌靈超臨界流體色譜分析方法。相比于目前采用的液相色譜方法，本方法可操作性強(qiáng)，雖然樣品溶液只能保證2 h的穩(wěn)定性，但已經(jīng)可以通過自動(dòng)進(jìn)樣的方式大幅提高樣品分析的便捷性。另外，通過本文結(jié)果驗(yàn)證了異氰酸正丁酯會(huì)造成苯菌靈結(jié)果測定的誤差，建議企業(yè)重新考察樣品溶劑的影響。