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    血腦屏障上有機陰離子轉運多肽的表達、分子調(diào)控及其介導的藥物轉運

    2021-11-01 05:33:36王敏胡冰瑩孫瑩瑩韋陽杭州醫(yī)學院浙江省神經(jīng)精神疾病藥物研究重點實驗室杭州310013
    中南藥學 2021年10期
    關鍵詞:轉運體微血管底物

    王敏,胡冰瑩,孫瑩瑩,韋陽(杭州醫(yī)學院,浙江省神經(jīng)精神疾病藥物研究重點實驗室,杭州 310013)

    血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)之間形成了三大屏障,即血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)、血腦脊液屏障和蛛網(wǎng)膜屏障,這些屏障為維持CNS的穩(wěn)態(tài)提供了高度可控的微環(huán)境。構成BBB結構基礎的微血管內(nèi)皮細胞(microvascular endothelial cells,MVECs)是介導血液-CNS之間物質(zhì)交換的主要場所,MVECs之間存在緊密連接,限制了離子和其他小的親水性溶質(zhì)通過細胞間隙(細胞旁途徑),因此,腦內(nèi)所需的一些營養(yǎng)分子包括氨基酸、一元羧酸、有機陽離子、己糖、核苷和肽等需要通過跨膜轉運途徑穿過BBB[1],而相關轉運蛋白的缺乏以及內(nèi)皮細胞囊泡含量低等因素則形成了一種“運輸屏障”。

    由于BBB在很大程度上限制了藥物向CNS的轉運,導致很多CNS疾病治療效果不佳甚至無效。因此越來越多的研究人員開始關注如何提高腦內(nèi)病灶部位的有效藥物濃度,改善藥物的治療效果。在大腦皮層,藥物的外排由三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白(ATP binding-cassette,ABC)的成員介導[2],參與藥物攝取的轉運蛋白則屬于溶質(zhì)轉運蛋白(solute carrier,SLC)家族[3]。BBB上的ABC超家族[如P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)]或SLC家族(如有機陰離子轉運多肽)轉運體是改善藥物向大腦輸送的重要靶點。值得注意的是,一些針對P-gp的小分子抑制劑的臨床試驗由于抑制劑本身的毒性或者腦內(nèi)非病灶組織對外源藥物的滲透性增強而產(chǎn)生嚴重的不良反應而失敗。為此,越來越多的人開始關注內(nèi)源性表達的SLC轉運體。

    有機陰離子轉運多肽(organic anion transport polypeptides,OATPs/Oatps),作為SLC超家族的一個重要成員,可通過鈉離子非依賴性轉運系統(tǒng)介導大量的兩親性化合物(包括多種藥物)的跨膜轉運。有研究證明,OATPs/Oatps可作為CNS藥物傳遞的潛在靶點,其底物如他汀類藥物,在缺氧、炎癥性疾病以及多發(fā)性硬化癥中具有較好的神經(jīng)保護作用[4]。同時OATPs/Oatps還可介導阿片類鎮(zhèn)痛藥(如deltorphin Ⅱ和DPDPE等)的血腦轉運,從而治療疼痛和腦缺氧[5]。本文旨在探討OATPs/Oatps在BBB上的定位、功能表達、分子調(diào)控機制及其介導的藥物轉運過程,以期為CNS疾病的臨床藥物治療提供新的思路。

    1 血腦屏障

    BBB由排列在腦微血管的內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接構成,包括基底膜、星形膠質(zhì)細胞、周細胞和神經(jīng)元在內(nèi)的“神經(jīng)血管單位”(neurovascular unit,NVU)也參與了其形成。腦微血管內(nèi)皮細胞外有一層連續(xù)不斷的基底膜,基底膜外又被星形膠質(zhì)細胞終足圍繞形成的膠質(zhì)膜所包圍,而周細胞是嵌入到微血管基底膜中的血管壁細胞,多層膜性結構共同形成了大腦的保護性屏障(見圖1)。

    圖1 血腦屏障[9]Fig 1 Blood-brain barrier[9]

    越來越多的研究表明,CNS疾病可能與BBB的功能障礙有關,包括一些神經(jīng)退行性疾病[如阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD)和帕金森病]和與炎癥相關的腦部疾?。ㄈ绺腥尽⒅酗L、血管性癡呆和多發(fā)性硬化癥)等[6-8]。

    2 有機陰離子轉運多肽

    OATPs/Oatps由溶質(zhì)載體有機陰離子轉運蛋白家族成員基因(solute carrier organic anion transporter family member,SLCO/slco)編碼,目前人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的OATP包括6個家族(OATP1~6)、12個亞型(OATP1A2、OATP1B1、OATP1B3、OATP1B7、OATP1C1、OATP2A1、OATP2B1、OATP3A1、OATP4A1、OATP4C1、OATP5A1、OATP6A1),關于基因SLCO1B7和轉運體OATP1B7的信息幾乎沒有文獻報道,OATP1B3-1B7(LST-3TM12)是最近發(fā)現(xiàn)的OATP1B家族的新成員,該功能轉運體是由SLCO1B3和SLCO1B7的剪接變異體共同編碼的產(chǎn)物,定位于肝微粒體滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,其底物包括硫酸脫氫表雄酮(DHEAS)和estradiol-17β-D-glucuronide等[10]。OATPs在人體組織中廣泛分布,但有些亞型廣泛表達,有些亞型選擇性表達在某個部位,在細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持和藥物的處置方面發(fā)揮著重要作用。

    2.1 OATPs/Oatps在BBB的定位與表達

    為了進一步優(yōu)化轉運體介導的腦靶向遞藥系統(tǒng),了解OATPs/Oatps在BBB的定位和功能表達至關重要,人OATPs和嚙齒動物Oatps在基因和蛋白質(zhì)表達以及底物譜方面存在明顯不同。

    定位于BBB的OATPs包括OATP1A2、OATP1C1、OATP2B1和OATP2A1。OATP1A2是第一個被鑒定且被證實在BBB中大量表達的OATP亞型,最初在人腦微血管和毛細血管內(nèi)皮細胞的頂端發(fā)現(xiàn)[11-12],后來證實,在腫瘤和鄰近的健康組織中也有表達[13],通過觀察大腦皮質(zhì)、小腦和海馬體的石蠟切片,發(fā)現(xiàn)OATP1A2也定位于神經(jīng)元和神經(jīng)元突起[14-15]。相對于其他組織,大腦中 OATP1A2 mRNA的表達水平更高,并且與OATP2B1和P-gp相比,全腦組織裂解液中OATP1A2蛋白豐度更高[14,16]。與OATP1A2相比,OATP2B1的定位似乎僅局限于腦毛細血管的內(nèi)皮細胞的管腔膜側。OATP1C1是BBB處甲狀腺激素(thyroid hormones,THs)的高親和力雙向轉運體,研究發(fā)現(xiàn)OATP1C1分布在放射狀膠質(zhì)細胞、腦屏障、Cajal-Retzius細胞、腦干的遷移纖維以及一些具有特殊和復雜時空模式的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中[17]。OATP1C1在BBB中的表達具有明顯的物種差異性,在大鼠和小鼠的微血管內(nèi)皮細胞上高度富集,而在人腦微血管內(nèi)皮細胞上表達量甚微。除此之外,OATP1C1還定位在脈絡層上皮細胞的基底側[18]。OATP2A1,也被稱為甲狀腺素轉運體,在全身組織包括大腦中廣泛表達,目前已在腦額回神經(jīng)元中檢測到其蛋白水平的表達,但其在BBB中的具體定位尚不清楚。

    嚙齒類動物BBB中主要表達3種Oatp亞型:Oatp1c1、Oatp2a1和Oatp1a4[19-21]。Admati等[21]通過Oatp1c1 mRNA探針和抗-EGFP抗體對轉基因魚進行了雙ISH/免疫組化,發(fā)現(xiàn)Oatp1c1在BBB的微血管內(nèi)皮細胞的頂端和基底側均有表達,同時也定位在特定腦區(qū)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。Kis等[22]研究表明,Oatp2a1定位在腦內(nèi)皮細胞的管腔膜側,其在BBB內(nèi)皮細胞中的表達量低于其在星形膠質(zhì)細胞、周細胞和脈絡層上皮細胞中的表達。Oatp1a4是人OATP1A2在BBB上的功能性同源物,但與OATP1A2不同,Oapt1a4定位于BBB微血管內(nèi)皮細胞的頂端和基底外側膜[23],這意味著它可能還充當著外排轉運體的功能[13,23]詳見表1和圖2。

    表1 OATPs/Oatps在BBB的定位及其底物Tab 1 Localization and substrates of OATPs/Oatps at the BBB

    圖2 OATPs/Oatps在BBB的定位Fig 2 Localization of OATPs/Oatps at the BBB

    2.2 OATPs/Oatps的分子調(diào)控

    要實現(xiàn)將OATPs/Oatps轉運體作為增強CNS藥物傳遞載體的目標,需要對其分子調(diào)控機制進行深入了解。遺傳多態(tài)性、翻譯和翻譯后調(diào)控以及與誘導劑或抑制劑的相互作用都有可能導致OATPs轉運功能的改變。

    2.2.1 OATP1A2和Oatp1a4 近年來,有關OATP1A2分子調(diào)控的研究越來越多,其啟動子中含有一個PXR反應元件,可通過與PXR結合,促進SLCO1A2的轉錄和翻譯[30]。位于SLCO1A2轉錄起始位點上游-1836~-1845 bp處有一個核因子-κB(nuclear factor-κB,NFκB)的可能結合位點,并且腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)可通過NFκB的負性調(diào)控進而抑制SLCO1A2的轉錄[31]。OATP1A2的翻譯后過程受到一組激酶,包括蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、酪蛋白激酶2(casein kinase 2,CK2)和AMP依賴的蛋白激酶(5'-AMP-activated protein kinase,AMPK)的復雜調(diào)控,PKC通過網(wǎng)格蛋白依賴性途徑介導蛋白內(nèi)化來調(diào)節(jié)OATP1A2的轉運功能[32],CK2通過調(diào)節(jié)其在質(zhì)膜上的定位,在優(yōu)化OATP1A2功能中起著關鍵作用[33],而AMPK則可調(diào)控OATP1A2的亞細胞定位和蛋白穩(wěn)定性[34]。PDZ蛋白,特別是盤狀同源區(qū)域蛋白1(PDZ domain containing 1,PDZK1)和鈉氫交換調(diào)控因子1(Na+/H+exchanger regulatory factor 1,NHERF1),通過與OATP1A2 C端的PDZ結合域直接相互作用激活OATP1A2功能[35]。

    OATP1A2的轉運活性還受pH值的影響,在pH 6.0條件下,OATP1A2介導的0.3 mmol·L-1雌酮3-硫酸鹽的攝取率比在pH 7.4時高6.6倍[36]。缺血和再灌注對OATP1的表達和功能也具有調(diào)節(jié)作用,細胞暴露于糖氧剝奪條件2 h后,OATP1的表達顯著增加[37]。Thompson等[38]也發(fā)現(xiàn)在缺氧1 h后的30 min復氧期間,大鼠體內(nèi)Oatp1a4的表達增加,而在較長的復氧過程中,Oatp1a4的表達卻降低,因此研究缺血再灌注過程中OATP1表達的分子調(diào)節(jié)機制具有重要的意義。

    已有研究證實TGF-β/ALK1信號激動劑BMP-9可增強大鼠腦微血管中Oatp1a4的功能性表達,而高選擇性ALK5抑制劑SB431542也可促進Oatp1a4介導的轉運過程,這表明Oatp1a4轉運功能可由通過ALK1和ALK5跨膜受體介導的TGF-β信號轉導調(diào)節(jié)[24,39]。

    2.2.2 OATP2B1 Pomari等[40]研究表明,驅(qū)動SLCO2B1轉錄的啟動子具有組織特異性。不同的啟動子啟動不同SLCO2B1轉錄本的表達。這些OATP2B1變體使用5個不同的第一外顯子(1a,1b,1c,1d和1e)和相關的啟動子,但共享后續(xù)的外顯子(外顯子2~14)。通過分析SLCO2B1的啟動子區(qū)域,發(fā)現(xiàn)5'側翼區(qū)域包含一個順式作用元件GC盒,它可與轉錄因子Sp1結合并控制來自肝臟和小腸的幾種細胞系的SLCO2B1表達[41]。肝細胞核因子4-α(hepatocyte nuclear factor 4-alpha,HNF4α)可 與SLCO2B1-1e近 端啟動子的某一區(qū)域結合激活其轉錄過程[42]。在HepaRG細胞中,MicroRNA-24的表達水平與OATP2B1 mRNA、蛋白質(zhì)和HNF4αmRNA的表達水平呈負相關,這表明MicroRNA-24不僅抑制OATP2B1的翻譯過程,而且可通過降解HNF4αmRNA抑制OATP2B1的轉錄過程[43]。抑瘤素M(OSM)是白細胞介素-6(IL-6)家族的一員,可以下調(diào)人肝細胞中OATP2B1的mRNA水平[44]。

    除了特征明確的轉錄修飾外,翻譯后修飾也會影響轉運蛋白的定位和活性。OATP2B1的轉運功能易受細胞外環(huán)IX-X半胱氨酸殘基變化的影響[45],OATP2B1中共有6個色氨酸殘基,即W272、W276、W277、W523、W611和W629,位于跨膜結構域11(transmembrane domain 6,TM11)的W611是影響OATP2B1轉運功能的關鍵部位,而位于第三細胞外環(huán)和TM6交界處的W272、W276和W277對OATP2B1的轉運功能也起到一定的影響[46]。OATP2B1的C端含有PDZ結合基序,PDZK1蛋白可通過與該區(qū)域結合調(diào)控其在細胞中的定位、表達和功能[47]。同源建模顯示OATP2B1 TM1以及N端末端的TM2,4和5可能位于底物結合口袋內(nèi),對維持轉運蛋白的攝取功能非常重要[48]。此外,第51位的苯丙氨酸(F51)似乎在OATP2B1的正確折疊中起著重要作用,因為F51的替代可能會導致轉運蛋白的加速降解[48]。有研究表明OATP2B1可通過PKC介導的網(wǎng)格蛋白內(nèi)在化,隨后被胞內(nèi)溶酶體靶向降解[49]。

    2.3 OATPs/Oatps介導的CNS藥物轉運

    2.3.1 抗AD藥 目前普遍認為AD患者一個特征性的病理改變是β-淀粉樣蛋白(Aβ)在大腦中不斷積累。有研究表明,作為Oatp1a4底物的瑞舒伐他汀和?;悄懰猁}可通過原位腦灌注降低小鼠大腦中的Aβ水平[50]。隨著病情的加重,AD大鼠腦毛細血管中的Oatp1a4的表達量呈下降趨勢[51],這在一定程度上影響了相關底物藥物進入腦內(nèi)病灶區(qū)發(fā)揮作用。

    2.3.2 治療缺血性腦中風的藥物 阿片肽Biphalin在缺血性腦中風時可提供神經(jīng)保護作用,他汀類藥物與中風后早期的神經(jīng)功能改善相關,而OATP1A2和Oatp1a4可介導阿片肽Biphalin和他汀類藥物在BBB的轉運過程,并且缺血再灌注期間OATP1表達的增加可以改善阿片肽Biphalin或其他與OATP1有親和力的潛在腦缺血治療藥物的腦部運輸[5,37-38]。

    2.3.3 抗腦部腫瘤藥 越來越多的證據(jù)表明,OATPs在各種類型的癌癥中的表達會發(fā)生改變,在蛋白質(zhì)水平上,OATP1A2和OATP2B1在形成BBB和血腦腫瘤屏障的內(nèi)皮細胞的管腔膜以及膠質(zhì)母細胞瘤細胞中均有表達,可介導一些化療藥物輸送到腫瘤部位[13,52]。AZD1775是一種酪氨酸激酶Wee1的小分子抑制劑,是治療膠質(zhì)母細胞瘤的潛在化療和放射增敏劑。在相對酸性的腫瘤微環(huán)境中,AZD1775主要通過OATP1A2介導的主動攝取過程進入腦腫瘤細胞[53]。越來越多的化療藥物被證明由OATP1A2和OATP2B1介導轉運,OATP1A2介導甲氨蝶呤(MTX)的轉運過程具有飽和性和pH依賴性,在細胞外酸性環(huán)境中,其轉運速率可提高7倍[54]。除此之外,OATP1A2介導轉運的化療藥物還包括伊立替康、阿霉素等,而SN-38(伊立替康的活性代謝產(chǎn)物)、厄洛替尼則由OATP2B1轉運。

    2.3.4 抗抑郁藥 圣約翰草可用于治療輕度抑郁癥,金絲桃苷是圣約翰草的主要活性成分之一,通過激活核受體中的孕烷X受體(pregnane X receptor,PXR)從而增強CYP3A4的表達,在合并用藥過程中可能引起嚴重的藥物-藥物或食物相互作用,限制了其臨床使用。金絲桃苷作為OATP2B1的底物,可通過OATP2B1跨膜轉運,因此OATP2B1可增加金絲桃苷的細胞攝取量,從而增強PXR的活化[55]。

    2.3.5 抗癲癇藥 在慢性癲癇大鼠的大腦中,Oatp1a4的蛋白水平顯著降低,而mRNA水平不變,這表明慢性癲癇可能影響了Oatp1a4的轉錄后過程[56]。丙戊酸鈉是臨床上最常用的抗癲癇藥,研究表明Oatp1a4參與了丙戊酸鈉在血腦屏障處的轉運,并且改變Oatp1a4的表達可能改善耐藥癲癇患者對丙戊酸鈉的耐藥性[57]。

    2.3.6 OATPs/Oatps的基因多態(tài)性對藥物轉運的影響 很多研究表明SLCO的基因多態(tài)性通過影響藥物轉運,從而顯著改變其底物藥物的藥理和毒理反應。Angelini等[58]報道了接受伊馬替尼治療的189例慢性粒細胞白血病患者的主要反應與包括OATP1A2在內(nèi)的幾種SLC轉運體的遺傳變異之間存在顯著關系。Zhou等[59]在一組受試者中鑒定了SLCO1A2的5個新的單核苷酸多態(tài)性(SNPs):G550A、G553A、G673A、A775C和G862A,它們分別編碼OATP1A2變體E184K、D185N、V255I、T259P和D288N。通過HEK293細胞評估這些變體轉運蛋白的功能,發(fā)現(xiàn)新的變異 體E184K、D185N、T259P和D288N對 底 物藥物雌酮-3-硫酸酯、伊馬替尼和MTX的轉運量明顯降低,僅為野生型的20%~50%。此外,SLCO1A2的遺傳變異也可能是類風濕關節(jié)炎患者MTX毒性產(chǎn)生的危險因素。Wang等[60]用二元Logistic回歸分析了SLCO1A2遺傳變異與MTX毒性的關系,結果顯示,550AA基因型與MTX毒性相關,并且H3(H3=AG)患者產(chǎn)生MTX毒性的風險較高。另一項體外研究也表明,相對于野生型,OAP1A2*3(A516C,E172D)和*6(A404T,N135I)變異體對3種測試底物即雌酮-3-硫酸酯、deltorphin Ⅱ和DPDPE的轉運活性均顯著降低[12]。

    OATP2B1 rs2306168(1457C>T)是一種錯義突變,與野生型相比,其轉運活性降低50%。據(jù)報道,非索非那定在體內(nèi)的消除受到OATP2B1 rs2306168的顯著影響,具有C等位基因的受試者體內(nèi)非索非那定曲線下面積(AUC)顯著降低[61]。另一項研究表明,與野生型受試者相比,具有SLCO2B1c.* 396T>C變異體的受試者伏立康唑的口服吸收慢且生物利用度降低[62]。

    這些數(shù)據(jù)表明SLCO1A2和SLCO2B1的基因多態(tài)性可能是藥物處置和進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的個體間變異性的一個重要的因素。因此,與OATP1A2和OATP2B1相關的遺傳變異不僅會影響內(nèi)源性和外源性化合物在外周器官(如腎臟、腸道)中的分布,還會改變向關鍵組織區(qū)室(如大腦)輸送藥物的程度,從而導致藥物反應性的個體間差異。

    3 總結與展望

    自從Oatp基因被發(fā)現(xiàn)以來,有機陰離子轉運多肽一直是研究者的關注點,人體相關的OATPs至今發(fā)現(xiàn)了12個亞型,其中OATP1B3-1B7尚未完全被確證。確認的11個OATP亞型影響著人體的生理功能,且在特定條件下可能成為疾病形成的關鍵因素。OATPs參與藥物的轉運,并有可能成為藥物治療的功能靶點。因此,對OATPs分布及功能的深入研究,對新藥研發(fā)有重要的意義。

    藥物穿過BBB并在CNS內(nèi)獲得有效濃度的能力取決于多種轉運機制。這些機制包括通過內(nèi)流轉運體進入大腦和由外排轉運體介導的外流過程。筆者總結了定位于BBB的OATPs/Oatps的表達,分子調(diào)控及其介導的藥物轉運過程,這為優(yōu)化神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物治療提供了新的靶點,包括TGF-β信號通路、核受體系統(tǒng)等。同時,發(fā)現(xiàn)細胞間信號通路存在復雜的相互作用,如ALK1和ALK5受體不僅參與調(diào)節(jié)Oatp1a4的轉運活性,還與P-gp的功能調(diào)節(jié)有關[63],這些對于研究Oatp1a4和P-gp共同底物的轉運具有重要意義。

    此外,必須意識到,在BBB中高表達的OATPs/Oatps也定位在外周的其他器官,并且參與藥物處置過程。例如,定位在腎小管上皮細胞頂端側的OATP1A2參與底物藥物的分泌[64],肝臟中表達的Oatp1a4則參與底物藥物的代謝[65],因此,需重點關注OATPs/Oatps表達的組織差異性以及調(diào)控其表達的下游信號之間的分岔點,使得治療CNS疾病的藥物更少地在外周被代謝和分泌。目前,大部分研究只關注CNS疾病發(fā)生和發(fā)展過程中BBB處藥物轉運體的改變,卻忽略了外周器官如肝臟、腎臟和小腸等部位關鍵藥物轉運體以及代謝酶的變化。有研究表明,在AD小鼠腎臟中,多藥耐藥相關蛋白2(MDR2)、OAT3和OCT2的蛋白表達分別上調(diào)1.6、1.3和1.4倍[66],這些改變可能會影響藥物在外周的吸收、分布、代謝和排泄過程,最終影響進入CNS的有效藥物濃度。

    在大腦發(fā)育過程中,轉運體蛋白的含量也在不斷變化,如在腦毛細血管發(fā)育過程中Oatp1c1蛋白表達的上坡型變化可能滿足了大腦正常發(fā)育對足夠甲狀腺激素的需求[67]。此外性別也可能會影響轉運體的表達,與雄性大鼠相比,雌性大鼠腦微血管Slco1a4mRNA和Oatp1a4蛋白表達增加,但在青春期前大鼠中未觀察到腦微血管Oatp1a4表達的性別差異性[68]。最后,轉運體介導藥物的轉運存在立體選擇性,一項臨床研究表明,單劑量攝入蘋果汁(含一種OATP2B1的有效抑制劑),可使其底物藥物非索非那定AUC0~24(R構型)/AUC0~24(S構型)從1.49增加到2.00[69]。因此,未來在CNS疾病的治療過程中,必須充分考慮到相關的生物變量,包括患者的年齡、性別和手性藥物轉運中的立體選擇性等,這有助于最大限度地發(fā)揮藥物的治療效果。

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