高血壓左心室肥厚患者血清miR-21、TGF-β1表達(dá)及臨床意義*

吳立國，高景芳，張書春，夏 娟

1.唐山南湖醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北唐山 063000；2.唐山工人醫(yī)院心內(nèi)二科，河北唐山 063000

高血壓是心血管疾病常見的危險因素，可導(dǎo)致器官損害和功能障礙，特別是對心臟射血功能造成巨大負(fù)荷。長期的高血壓會增加左心室負(fù)荷，使左心室形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，導(dǎo)致左心室肥厚[1]。高血壓左心室肥厚發(fā)病機制目前還沒有明確，有學(xué)者認(rèn)為心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡可能與高血壓左心室肥厚的發(fā)病機制有關(guān)[2]。目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)可調(diào)控高血壓及其相關(guān)疾病的基因表達(dá)[3-4]。miR-21作為一類新型內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)展[5]。多種生長因子對左心室肥厚的形成具有不可替代的作用，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是最有效、最普遍的調(diào)節(jié)心肌肥厚、促纖維生成的細(xì)胞因子[6]。已有研究證實，miR-21可通過靶向抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白7(Smad7)，從而促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)心肌纖維化[7]。但關(guān)于miR-21和TGF-β1在高血壓左心室肥厚的形成中作用的報道較少見。因此本研究將探討miR-21和TGF-β1在高血壓左心室肥厚患者血清中的表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年10月至2020年10月唐山南湖醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的原發(fā)性高血壓患者122例作為研究對象，其中男64例，女58例，年齡48～70歲，平均(60.04±6.08)歲，病程5～16年，平均(11.57±3.01)年。收集患者入院靜坐時收縮壓、靜坐時舒張壓數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國高血壓防治指南(2018年修訂版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)愿意配合此次試驗者；(3)入選患者了解本次研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有惡性腫瘤患者；(2)除高血壓外，患者有明確的心血管疾病史；(3)患者有自身免疫性疾病、造血系統(tǒng)疾病等。本研究通過唐山南湖醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2左心室肥厚判定方法 所有患者均由一名有經(jīng)驗的醫(yī)師采用GE LOGIQ F Series型彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)(探頭頻率10～12 MHz)測量室間隔厚度(IVST)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左心室后壁厚度(LVPWT)。根據(jù)Devereux校正公式：計算左心室質(zhì)量(LVM)，LVM=0.8×1.04×[(IVST+LVEDD+LVPWT)3-LVEDD3]+0.6。收集患者身高、體質(zhì)量數(shù)據(jù)，根據(jù)身高和體質(zhì)量計算體表面積(BSA)，計算公式：BSA(女)=0.007 3×身高+0.012 7×體質(zhì)量-0.210 6；BSA(男)=0.005 7×身高+0.012 1×體質(zhì)量+0.088 2；BSA單位是m2，身高單位是cm，體質(zhì)量單位是kg。根據(jù)BSA計算左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)，LVMI=LVM/BSA。以男性LVMI≥115 g/m2，女性LVMI≥95 g/m2為判定左心室肥厚的判定標(biāo)準(zhǔn)[9]。本研究中高血壓患者根據(jù)是否發(fā)生左心室肥厚分為左心室肥厚組35例和非左心室肥厚組87例。

1.3試劑及儀器 RNA提取試劑盒(批號R1200-100)購自北京索萊寶科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號QR0100)、熒光定量PCR試劑盒(2×SYBR Green qPCR Mix)(批號RR047A)、熒光定量PCR參比染料(ROX Reference Dye)(批號RS109)均購自日本Takara公司；人TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號DB100B)購自美國R&D公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號CFX96)、酶聯(lián)免疫檢測儀(型號680)均購自美國Bio-Rad公司。

1.4研究方法

1.4.1樣品采集 采集所有患者清晨空腹靜脈血5 mL裝于普通采血管中，4 ℃，3 000 r/min，離心8 min，留上清液，凍存于-80 ℃冰箱中，待測。

1.4.2熒光定量PCR檢測血清中miR-21的表達(dá) 使用RNA提取試劑盒提取樣品中總RNA，檢測所得RNA純度，總RNA依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用qRT-PCR儀對miR-21及內(nèi)參U6進(jìn)行擴增反應(yīng)，miR-21正向引物5′-AAA GTT GTA GTC AGA CTA TTC GAT-3′，反向引物5′-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT-3′。內(nèi)參U6正向引物5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，反向引物5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。引物由北京索萊寶科技有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，正向和反向引物各2 μL，cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 4.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；38個循環(huán)。對miR-21相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計算。

1.4.3檢測血清中TGF-β1水平 采用ELISA法檢測血清中TGF-β1水平，操作步驟嚴(yán)格依據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者基線資料比較 左心室肥厚組和非左心室肥厚組在性別、年齡上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與非左心室肥厚組相比，左心室肥厚組患者高血壓病程、靜坐時收縮壓、靜坐時舒張壓較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者基線資料比較

2.2左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI水平比較 與非左心室肥厚組相比，左心室肥厚組患者IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI水平比較

2.3左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者血清miR-21和TGF-β1水平比較 與非左心室肥厚組相比，左心室肥厚組患者血清miR-21、TGF-β1水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者血清miR-21和TGF-β1水平比較

2.4高血壓患者血清miR-21、TGF-β1與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，高血壓患者血清miR-21與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，血清TGF-β1與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見表4。

表4 高血壓患者血清miR-21、TGF-β1水平與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI的相關(guān)性分析

2.5血清miR-21、TGF-β1及兩者聯(lián)合對高血壓左心室肥厚診斷價值分析 繪制ROC曲線結(jié)果顯示，miR-21、TGF-β1單項及聯(lián)合檢測診斷高血壓左心室肥厚的曲線下面積(AUC)分別為0.882(95%CI：0.812～0.952)、0.847(95%CI：0.772～0.922)、0.947(95%CI：0.908～0.987)。見表5和圖1。

表5 血清miR-21、TGF-β1及兩者聯(lián)合對高血壓左心室肥厚診斷價值

圖1 ROC曲線分析血清miR-21、TGF-β1單項及聯(lián)合檢測對高血壓左心室肥厚的診斷價值

3 討 論

高血壓是一種全身性慢性疾病，主要表現(xiàn)為體循環(huán)動脈血壓升高。早期血壓控制不好，持續(xù)升高，會使左心室心肌持續(xù)處于超負(fù)荷工作狀態(tài)，導(dǎo)致左心室代償性肥厚發(fā)生。另有報道顯示，長期心臟壓力負(fù)荷會刺激成纖維細(xì)胞增殖、心肌細(xì)胞胞外基質(zhì)膠原過度沉積，最終導(dǎo)致心肌纖維化，促進(jìn)左心室肥厚[10]。據(jù)報道，高血壓患者發(fā)生左心室肥厚的概率為20.00%～30.00%，心室肥厚是心臟事件致死及全因死亡的獨立危險因素[11]。分析左心室肥厚形成的機制有助于高血壓左心室肥厚的診斷和治療。

心肌成纖維細(xì)胞的增殖和心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化是心肌纖維化的關(guān)鍵。TGF-β是結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的多肽生長因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化，一共有5種亞型。目前哺乳動物中有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β1位于19q13染色體上，在體細(xì)胞系中分布最廣泛、活性最強。TGF-β與多種疾病的發(fā)病機制相關(guān)，如肺纖維等纖維化疾病[12]。TGF-β1是心肌纖維化的主要調(diào)節(jié)因子，可通過TGF-β1/Smad信號通路減少細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)Ⅰ型膠原等蛋白合成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化[13]。夏勇等[14]報道高血壓粥樣硬化斑塊患者和增厚患者TGF-β1水平明顯高于頸動脈正常的高血壓患者；高血壓左心室肥厚患者TGF-β1水平明顯高于無左心室肥厚患者，同時發(fā)現(xiàn)TGF-β1與LVMI水平呈正相關(guān)關(guān)系，表明TGF-β1與高血壓患者左心室肥厚有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)左心室肥厚組患者血清TGF-β1水平顯著高于非左心室肥厚組患者，提示TGF-β1可能與高血壓左心室肥厚發(fā)生有關(guān)系，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血清TGF-β1與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證實了TGF-β1可能參與高血壓左心室肥厚的發(fā)生。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)血清TGF-β1對高血壓左心室肥厚診斷的AUC為0.847，靈敏度為81.40%，特異度為78.50%，提示TGF-β1在臨床上對高血壓左心室肥厚的評估可能比較可靠。

miRNA是一類長度19～25個核糖核苷酸的單鏈小分子RNA，常作為內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子參與心臟疾病的發(fā)生過程，包括心肌纖維化[15]。與心肌纖維化有關(guān)的幾種miRNAs中，miR-21因其靶點在腎、肝等多個器官的纖維化中發(fā)揮重要作用而受到特別關(guān)注[16-17]。人miR-21位于染色體17q23.2區(qū)域，與其他miRNA不同，其有獨立的啟動子區(qū)域。ZHOU等[18]在大鼠實驗中發(fā)現(xiàn)miR-21能夠靶向降解Jagged1蛋白，促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和心肌纖維化形成。薛貽敏等[19]在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，miR-21可促進(jìn)慢性病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化，這一過程是通過介導(dǎo)TGF-β1/Smad7信號通路實現(xiàn)的。孟華等[20]報道m(xù)iR-21通過抑制Smad7表達(dá)，增強心臟成纖維細(xì)胞的增殖，加重心肌梗死后心肌纖維化，表明miR-21是作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)心肌纖維化，而非作用于心肌細(xì)胞本身，推測miR-21可能參與高血壓左心室肥厚的心肌纖維化過程。周湘鴻等[21]報道高血壓左心室肥厚患者miR-29b水平明顯高于高血壓非左心室肥厚患者，與高血壓左心室肥厚呈正相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)左心室肥厚組患者血清miR-21水平顯著高于非左心室肥厚組患者，提示miR-21可能參與高血壓左心室肥厚發(fā)生，猜測miR-21是通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞心肌纖維化，促進(jìn)高血壓患者左心室肥厚的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-21與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關(guān)關(guān)系，證實了miR-21與高血壓患者的左心室肥厚發(fā)生具有緊密聯(lián)系。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-21對高血壓左心室肥厚診斷的AUC為0.882，靈敏度為74.40%，特異度為92.40%；血清miR-21和TGF-β1聯(lián)合對高血壓左心室肥厚診斷的AUC為0.947，靈敏度為95.30%，特異度為83.50%，兩者聯(lián)合診斷的AUC顯著高于單獨診斷時AUC，提示兩者聯(lián)合檢測對高血壓左心室肥厚診斷效果可能更好。本研究從臨床上分析了miR-21和TGF-β1對高血壓左心室肥厚的評估價值，為預(yù)測高血壓患者是否發(fā)生左心室肥厚提供了理論基礎(chǔ)，為高血壓左心室肥厚疾病在醫(yī)學(xué)上的研究進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，高血壓左心室肥厚患者血清miR-21和TGF-β1水平上調(diào)，兩者對高血壓左心室肥厚具有較好的評估價值，兩者聯(lián)合診斷效果更好。