分光光度法測定食品中亞硝酸鹽含量標準曲線線性范圍的研究

魏文強

摘 要：采用《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中第二法可見分光光度法測定食品中亞硝酸鹽的過程中，經(jīng)常出現(xiàn)所測定的食品中亞硝酸鹽含量超過標準曲線的檢測范圍、標準曲線主體部分的吸光度值不在分光光度法最佳范圍0.2～0.8的問題。表明國家標準建議使用的亞硝酸鈉標準溶液的濃度梯度范圍有限，標準曲線線性范圍較窄，只能用于測定亞硝酸鹽含量較低的食品，而對于含量超過標準曲線最高點的食品，則還需要進一步稀釋后才能測定，增加了檢測人員的工作量。經(jīng)過多次實踐，對標準曲線的范圍進行了適當擴展，使標準曲線能直接適用于高含量亞硝酸鹽食品的檢測，以達到提高食品檢測的檢測效率和穩(wěn)定性的目的。

關(guān)鍵詞：食品;可見分光光度法;亞硝酸鹽;標準曲線

亞硝酸鹽是一種廣泛使用的食品添加劑，是我國允許使用的食品添加劑之一。常用于乳制品、肉類、腌漬蔬菜等食品加工行業(yè)，剩菜剩飯、久置的蔬菜和白開水中也會產(chǎn)生亞硝酸鹽。亞硝酸鹽具有良好的防腐抗氧化、發(fā)色及抑菌等作用，能延長食品的保質(zhì)期，使食物顏色更鮮艷、味道更鮮美，但亞硝酸鹽存在一定的毒性，若過量使用會嚴重影響人們的身體健康。亞硝酸鹽進入人體血液后，會使血紅蛋白變性，血液的攜氧能力降低，造成人體缺氧癥狀，影響人的生命健康[1]。亞硝酸鹽在人體內(nèi)很容易與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物在酸性條件下反應轉(zhuǎn)換成亞硝胺，而亞硝胺是一種強致癌物質(zhì)，大量或長時間攝入能夠誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生，所以必須對食品中的亞硝酸鹽含量進行控制和定量檢測[2]。

1 分光光度法測定亞硝酸鹽標準曲線制作存在的問題

目前，我國檢測食品中亞硝酸鹽的方法依據(jù)《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016），檢測方法有離子色譜法和分光光度法[3]。分光光度法具有簡單、快速、靈明度高、經(jīng)濟等優(yōu)點，被各檢測實驗室廣泛使用，但在實際的檢測工作發(fā)現(xiàn)分光光度法在標準曲線存在以下兩個方面的問題。

1.1 標準曲線線性范圍較窄，高含量食品無法直接測定

根據(jù)《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規(guī)定腌臘肉制品類、肉灌腸類、醬鹵肉制品類等食品殘留量以亞硝酸鈉計，殘留量≤30 mg/kg，西式火腿（熏烤、煙熏、蒸煮火腿）類、肉罐頭類等食品殘留量以亞硝酸鈉計，殘留量≤70 mg/kg[4]。按照標準曲線系列濃度里最高點12.5 μg進行計算，取樣品西式火腿5.000 g，代入亞硝酸含量計算公式進行計算，得出該標準曲線的最高點的亞硝酸鈉含量為12.5 mg/kg，因此當西式火腿、肉罐頭等樣品中的亞硝酸鹽含量大于12.5 mg/kg時，按照分光光度法測定，樣品的吸光度值一定大于標準曲線的最高點的吸光度值，超出了標準曲線的范圍，所測定值誤差較大，不能使用。對亞硝酸鈉含量低于12.5 mg/kg檢測樣品可以直接進行測定，但對于亞硝酸含量大于12.5 mg/kg檢測樣品需要進行稀釋后，才能進行測定，當大批量進行樣品檢測時，給檢測工作帶來了額外的工作負擔，造成了試劑的浪費和人力的消耗，同時也會因樣品進行二次稀釋造成最終結(jié)果不準確，導致誤差變大[5]。

1.2 標準曲線各點的吸光度值偏低，不在最佳范圍內(nèi)

吸光度值過大過小都會造成測量誤差。吸光值過小，造成儀器信噪比下降，使分析誤差增大。吸光值過大，會因為雜散光的影響，造成分析結(jié)果偏大或偏小，使分析誤差變大。由朗博-比爾定律可知，當普通的分光光度計吸光度值為0.434 3時，吸光度的測量誤差最小。使用分光光度法測定樣品時，吸光度讀數(shù)最佳范圍應為0.2～0.8，同時所測定的樣品吸光度值要低于標準系列中的最大吸光度值[6]。采用分光光度計對亞硝酸鹽標準系列最高點12.5 μg的吸光度值進行了反復多次測定，得出的最高吸光度值為0.253 5，標準系列共9個點，其余各標準系列點的吸光度值均小于0.2，表明亞硝酸鹽的標準曲線不在最佳的線性范圍內(nèi)，得到標準曲線可能不符合質(zhì)控要求，造成最終的測量結(jié)果誤差較大。

為了解決以上存在的兩個問題，提高工作效率，盡量減少實驗誤差，保證檢測結(jié)果的準確性，在《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中第二法分光光度法線性范圍的基礎上對標準曲線的點進行適當?shù)臄U展。

2 材料與方法

2.1 實驗試劑

亞硝酸鈉標準溶液（200 μg/mL）、四硼酸鈉（分析純）、對氨基苯磺酸（分析純）、鹽酸萘乙二胺（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、冰乙酸（分析純）、鹽酸（分析純）、蒸餾水。

2.2 儀器與設備

紫外分光光度計（UV8000s）：上海元析儀器有限公司;電子天平（Quintix224-1CN，感量0.1 mg）：德國賽多利斯科學儀器有限公司;HH-6恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

2.3 實驗方法

2.3.1 改進方法一標準曲線的繪制

取9支50 mL具塞比色管，保持標準中亞硝酸鈉標準使用液的濃度（5 μg/mL）不變，僅改變亞硝酸鈉標準使用液的吸取量，分別加入0.00 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、

2.50 mL、3.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL（相當于0.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg、12.5 μg、15.0 μg、20.0 μg、30.0 μg、40.0 μg），再分別加入2 mL的4 g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后各加入1 mL的2 g/L鹽酸萘乙胺溶液，加水至刻度，混勻，制得標準系列溶液，室溫下顯色15 min后，以零號管為空白參比，在538 nm波長下測定吸光度。

2.3.2 改進方法二標準曲線的繪制

取9支50 mL具塞比色管，改變標準中亞硝酸鈉標準使用液的濃度，從5 μg/mL改變成20 μg/mL，保持亞硝酸鈉標準使用液的吸取量不變，分別加入0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、

0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL、1.50 mL、2.00 mL（相當于0.0 μg、4.0 μg、8.0 μg、12.0 μg、16.0 μg、20.0 μg、24.0 μg、30.0 μg、40.0 μg），再分別加入2 mL的4 g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后各加入1 mL的2 g/L鹽酸萘乙胺溶液，加水至刻度，混勻，制得標準系列溶液，室溫下顯色15 min后，以零號管為空白參比，在538 nm波長下測定吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩種改進方法的標準曲線的比較

由表1和圖1可知，改進方法一的標準曲線方程為y=0.020 8x+0.000 2，改進方法二的標準曲線方程為y=0.021 1x-0.000 4，兩條曲線的相關(guān)系數(shù)都在0.999以上，各項均符合要求，能滿足測定要求，圖1中標準曲線一斜率與標準曲線二斜率幾乎一致因此被覆蓋。

3.2 實驗驗證

將已知濃度的標準樣品進行吸光度值測定，然后分別帶入標準曲線一、二計算。由表2可知，標準曲線一、二得到的標準樣品濃度均在理論值范圍內(nèi)。

4 結(jié)論

在《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中第二法分光光度法的基礎上對標準曲線的點進行適當?shù)財U展，標準曲線主體部分的吸光度值在0.2～0.8。亞硝酸鹽含量較高的待測樣品的吸光度值涵蓋在標準曲線范圍內(nèi)，能夠滿足亞硝酸鹽含量較高的食品檢測，不需要對樣品進一步稀釋，這兩種改進方法擴大了亞硝酸鹽的檢測范圍，具有操作簡單、靈敏度高、結(jié)果準確的特點，可以代替原有的標準曲線，且不影響實驗結(jié)果，能夠滿足日常的檢驗要求，值得在實際檢測工作中推廣。

參考文獻

[1]付傳鵬.淺析肉類食品亞硝酸鹽含量測定中的問題[J].山西醫(yī)療雜志，2020，49（21）：2990-2992.

[2]丁小禮，名朋，曾觀紅.分光光度法測定深色肉制品中亞硝酸鹽含量[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，2016（2）：10-14.

[3]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理局.食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定：GB 5009.33—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品添加劑使用標準：GB 2760—2014[S].北京：中國標準出版社，2014.

[5]卞玲娟，何浩.改進分光光度法測定食品中的亞硝酸鹽含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2017，8（4）：1490-1493.

[6]黃一石，吾朝華，楊小林.儀器分析（2版）[M].北京：化學工業(yè)出版社，2008.