銀杏總黃酮調(diào)控動脈硬化大鼠自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

王穎超

(青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810016)

0 引言

自噬可以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，當(dāng)自噬嚴(yán)重會引起細(xì)胞死亡，自噬發(fā)生時，損傷的細(xì)胞成分可以被清除，進(jìn)而延遲動脈粥樣硬化進(jìn)程，使得內(nèi)皮細(xì)胞抵抗炎癥分子，氧化應(yīng)激等，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡和壞死的產(chǎn)生[5-7][10-11]。銀杏總黃酮是中藥材銀杏的主要有效成分，通過以往的相關(guān)研究表明[1-4]，銀杏總黃酮在維護(hù)心血管氧化應(yīng)激、清除體內(nèi)自由基等作用方面具有一定作用，被譽(yù)為心臟病的維護(hù)者。有專門研究已經(jīng)證實白藜蘆醇通過p38通路誘導(dǎo)自噬的發(fā)生進(jìn)而延緩動脈粥樣硬化[11]，故本研究以AS大鼠模型為研究對象，以白藜蘆醇為陽性藥物對照來探討銀杏總黃酮對AS大鼠主動脈自噬相關(guān)基因beclin-1及LC3表達(dá)水平的影響，以闡明銀杏總黃酮抗動脈粥樣硬化的原理，為銀杏的臨床應(yīng)用有著科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

雄性SD大鼠，體重160g至190g，由甘肅醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。銀杏總黃酮由上海源葉生物公司提供，總黃酮度56.2%；白藜蘆醇由上?；脤崢I(yè)公司提供，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、丙二醛試劑盒由維百瑞生物公司提供；beclin-1及LC3的 Elisa試劑盒等購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建動物模型

采用SD大鼠60只。隨機(jī)分為6組：正常對照組(CON)、模型對照組(AS)、白藜蘆醇組(Res)、銀杏總黃酮低、中、高劑量組(YXZ-L、YXZ-M、YXZ-H)。CON組給予注射生理鹽水，其余組按照30mg/kg標(biāo)準(zhǔn)量腹腔注射維生素D3，以及高脂飼料喂食。CON組和AS組則采用等體積生理鹽水灌胃，同時給予銀杏總黃酮按照125、250、500 mg/kg 的劑量灌胃，白藜蘆醇組則以150mg/kg灌胃。

1.2.2 主動脈HE染色

SD大鼠處死后，固定采用4%福爾馬林液，脫水及包埋切片，使用HE染色后觀察大鼠內(nèi)皮損失狀況。

1.2.3 氧化指標(biāo)測定

詳細(xì)遵照試劑盒說明書方法，測定血漿中SOD、GSH-Px 活性和CAT、MDA活性變化。

1.2.4 主動脈beclin-1及微管相關(guān)蛋白LC3表達(dá)測定

取主動脈，按照elisa試劑盒說明書方法測定蛋白相對表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠動脈粥樣硬化時血管內(nèi)皮損傷改變

由HE染色結(jié)果可知：CON組血管內(nèi)皮無損失，表面無炎性細(xì)胞且無脂質(zhì)沉積，未見管腔狹窄；模型對照組內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)彈力膜消失或損壞，血管管腔增厚，泡沫細(xì)胞形成，脂質(zhì)沉積嚴(yán)重，血管結(jié)構(gòu)已經(jīng)欠完整；銀杏總黃酮低劑量和銀杏總黃酮中劑量組主動脈內(nèi)皮無明顯損傷，僅見血管腔輕微增厚，輕微炎性細(xì)胞浸潤，輕微脂質(zhì)沉積，泡沫細(xì)胞罕見；銀杏總黃酮高劑量組和白藜蘆醇組血管內(nèi)膜有所輕微增厚，內(nèi)皮細(xì)胞水腫不明顯，僅見少量內(nèi)皮層撕裂，脂質(zhì)沉積較少，沒有發(fā)現(xiàn)泡沫細(xì)胞(見圖1)。

圖1 AS大鼠主動脈病理切片[HE染色、(400)]，A為正常對照組，B為模型對照組，C為銀杏總黃酮低劑量組，D為銀杏總黃酮中劑量組，E為銀杏總黃酮高劑量組，F(xiàn)為白藜蘆醇組；圖片箭頭所指為血管內(nèi)膜

2.2 氧化應(yīng)激的差異

CON組比AS組GSH-Px、SOD、CAT的表達(dá)活性均顯著下降(P<0. 01)，MDA表達(dá)含量顯著提升(P<0. 01)；與AS組比較，YXZ-L組MDA表達(dá)含量下降(P<0. 05)，YXZ-M組SOD、GSH-Px 表達(dá)活性提升(P<0. 05)，MDA 含量下降(P<0. 05)，YXZ-H組和白藜蘆醇組GSH-Px、SOD、CAT 表達(dá)量均提升(P<0. 01)，MDA表達(dá)含量下降(P<0. 01)；證明銀杏總黃酮和白藜蘆醇都延緩動脈粥樣硬化，機(jī)制是降低AS大鼠血清中MDA的含量，提升AS大鼠血清中GSH-Px、SOD、CAT的表達(dá)(見表1)。

表1 銀杏總黃酮對AS大鼠GSH-Px、SOD、CAT 和 MDA等因子表達(dá)的影響(±s)

表1 銀杏總黃酮對AS大鼠GSH-Px、SOD、CAT 和 MDA等因子表達(dá)的影響(±s)

注：*與正常對照組相比較，P<0.01；**：與粥樣硬化組相比較，P<0.05。

Group n SOD(U/mL) GSH-Px(U/mL) CAT(U/g) MDA(μmol/L)Control 10 71.13±10.39 81.28±21.39 212.95±31.86 6.72 ±1.84 Model 10 51.53±10.16* 33.52±10.29* 112.28±21.64* 11.18±3.46*Res YXZ-L 10 10 73.11±745**56.52±7.84**53.16±11.31**43.59±10.38**152.98±24.75**131.64±24.64**8.19 ±2.14**9.21±2.16**YXZ-M 10 70.53±11.7** 44.78±12.35** 131.52±24.92** 7.49±3.94**YXZ -H 10 74.35±11.6** 59.76±11.21** 161.27±31.13** 9.45±1.14**

2.3 beclin-1及LC3蛋白表達(dá)

正常對照組beclin-1與 LC3蛋白的表達(dá)極低，而模型對照組beclin-1與 LC3蛋白表達(dá)有所升高，但并不明顯(P<0.01)；銀杏總黃酮組和白藜蘆醇組自噬程度均高于正常對照組，并較模型組表達(dá)也明顯升高(P<0.01)。提示銀杏總黃酮延緩動脈粥樣硬化機(jī)制是上調(diào)AS大鼠beclin-1與 LC3蛋白的表達(dá)(見圖2)。

圖2 ELISA檢測AS大鼠主動脈beclin-1與 LC3蛋白的表達(dá)

3 討論

60天后切片主動脈驗證了大鼠粥樣硬化動物模型成功，且檢測血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)發(fā)現(xiàn)AS組比CON組GSH-Px、SOD、CAT表達(dá)含量均明顯下降，MDA 含量升高，說明動脈粥樣硬化時大鼠抗氧化能力下降，雙重證實該動物模型復(fù)制成功[4]。銀杏總黃酮最重要的活性成分為總黃酮和萜內(nèi)酯，有顯著的擴(kuò)張血管、抗氧化能力，能延緩衰老、保護(hù)心血管系統(tǒng)、清除體內(nèi)自由基[1-4]。程嘉藝[1]等研究證實銀杏總黃酮降低Caspase-3表達(dá)從而對抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。苑博等[9]研究發(fā)現(xiàn)銀杏總黃酮抑制NF-kapaB通路進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏總黃酮可以明顯降低LC3和beclin-1表達(dá)，抑制自噬的過度表達(dá)從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生。

自噬是一種在細(xì)胞溶酶體中發(fā)生的消化蛋白質(zhì)和細(xì)胞器活性的相對一個保守的機(jī)制，正常水平的自噬可自動修復(fù)機(jī)體損傷，過度的自噬過程會加速組織細(xì)胞凋亡[7][11]。既往研究驗證，自噬與心血管疾病有關(guān)。在急性缺血再灌注、擴(kuò)張性心肌病、高血壓心臟病以及衰老心肌中均發(fā)現(xiàn)了自噬的存在，自噬在動脈粥樣硬化中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[11]。巨噬細(xì)胞的自噬減少了泡沫細(xì)胞的積聚，抑制了斑塊形成。巨噬細(xì)胞的自噬減少斑塊中炎癥，穩(wěn)定斑塊，平滑肌細(xì)胞的自噬會加速纖維帽向變薄的方向發(fā)展，使斑塊不穩(wěn)定[5-6][10-12]。Martinet等[7]認(rèn)為，氧自由基引起beclin-1的高表達(dá)后，抗氧化可顯著降低beclin-1，這說明，活性氧是通過調(diào)節(jié)beclin-1的表達(dá)調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化細(xì)胞自噬[12]。Verheye等[5-7]發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均存在自噬現(xiàn)象。

Beclin-1是公認(rèn)的的在動物身上發(fā)現(xiàn)的自噬基因，在溶酶體自噬降解途徑中起腫瘤抑制作用，對自噬體形成很重要[7-8]；LC3是哺乳動物細(xì)胞中酵母自噬相關(guān)基因8的同源物，LC3 的表達(dá)與自噬泡的多少成正相關(guān)，因此，LC3 被認(rèn)為是自噬體的標(biāo)志分子，作為檢測機(jī)體自噬程度，研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬，導(dǎo)致LC3和Beclin-1表達(dá)增加，在大劑量膽固醇存在下，LC3蛋白含量升高，自噬泡聚集，自噬的抑制劑3-甲基腺嘌呤明顯抑制由膽固醇負(fù)荷誘導(dǎo)的自噬發(fā)生[13-14]。既往證實白藜蘆醇通過p38通路誘導(dǎo)自噬的發(fā)生進(jìn)而保護(hù)粥樣硬化[11]，本研究以白藜蘆醇為陽性藥物對照，結(jié)果表明銀杏總黃酮均能上調(diào)自噬相關(guān)基因beclin-1蛋白和 LC3蛋白表達(dá)，產(chǎn)生抗氧化作用，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞粥樣斑塊或細(xì)胞浸潤，阻止氧化應(yīng)激預(yù)防動脈粥樣硬化，自噬在動脈粥樣硬化中的作用將有可能為動脈粥樣硬化的防治提供新的治療靶點(diǎn)，但銀杏總黃酮如何通過自噬抑制機(jī)體氧化的詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。