尿激酶原聯(lián)合瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡及梗死面積的影響

趙曉寧，劉志遠，劉江波，李 綱，張松雨，張金盈

(1.南陽市中心醫(yī)院 心血管內科，河南 南陽473009；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 心血管內科，河南 鄭州450052)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠狀動脈供血不足引起的心肌缺血缺氧性疾病，在歐美國家具有較高的發(fā)病率，近年來我國AMI也呈現出逐漸升高的趨勢[1-2]。瑞舒伐他汀(RSV)目前常用于高脂血癥、冠心病等疾病預防，還具有降血脂、抗炎、抗氧化以及免疫調節(jié)等作用[3]。已有研究表明RSV可以降低AMI細胞凋亡，改善AMI心室重塑以及心功能損害作用。尿激酶原(pro-UK)對纖維蛋白纖溶酶原具有激活作用，具有溶栓功能，與傳統(tǒng)的溶栓藥物相比具有不良反應小、療效顯著等優(yōu)點[4-5]。目前pro-UK聯(lián)合RSV對AMI心肌影響的相關報道較少，本研究通過制備AMI大鼠模型，探索pro-UK聯(lián)合RSV對其心肌組織可能存在的影響，希望能為AMI藥物治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與動物

1.1.1實驗動物 SD大鼠，雄性，60只，4-5周齡，體質量(250±20)g，無特定病原體(SPF)級別，購自南方醫(yī)科大學【許可證號，SCXK(粵)2016-0041】，在SPF級飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)，購回后適應性飼養(yǎng)1周，符合動物3R標準。

1.1.2主要試劑及儀器 Bcl相關X蛋白(Bax)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、cleaved-Caspase-3抗體(上海恒斐生物科技有限公司)，瑞舒伐他汀(阿斯利康生物制藥有限公司)，尿激酶原(上海熹垣生物科技有限公司)，氯化三苯硝基四氮唑紅(TTC)(上海源葉生物科技有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(上海遠慕生物科技有限公司)，腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ) ELISA試劑盒(上海恪敏生物科技有限公司)。冷凍離心機(EXPERT 15K-R，湖南吉爾森科技發(fā)展有限公司)，石蠟切片機(HM325，英國賽默飛公司)，顯微鏡(XDS-800C，上海蔡康光學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及模型制備 將60只SD大鼠按體重隨機均分為假手術組、模型組、RSV組、RSV+尿激酶原組，其中模型組、RSV組、RSV+尿激酶原組用于AMI模型制備，參考文獻[6]運用結扎左冠動脈前降支方法制備AMI模型，并且各組大鼠在術后腹腔注射40萬單位青霉素，連續(xù)5 d，預防術后感染，假手術組大鼠只進行至穿線步驟但不進行結扎。RSV組、RSV+尿激酶原組術后次日灌胃RSV，劑量為1 mg/(kg·d)；RSV+尿激酶原組增加尿激酶原干預，首次進行靜脈注射尿激酶原1 mg/kg，之后靜脈注射0.25 mg/(kg·d)，一周一次，假手術組、模型組大鼠均灌胃相同體積生理鹽水，連續(xù)干預4周。

1.2.2樣品采集 末次干預結束后24 h，然后再對各組大鼠的血流動力學進行檢測，檢測完成后，再將各組大鼠麻醉處死，迅速取出完整的心臟組織，分別用于心肌梗死、心肌組織HE染色、TUNEL凋亡、心肌組織氧化應激及炎性因子水平以及Western blot檢測。

1.2.3血流動力學檢測 將導管經右頸總動脈插入左心室，記錄各組大鼠的平均動脈壓(MAP)，左心室的收縮壓(LVSP)、舒張末壓(LVEDP)、內壓下降的最大速率(LV-dp/dtmax)、內壓上升的最大速率(LV+dp/dtmax)。

1.2.4TTC/Evans blue檢測 將取出心臟置于預冷4℃生理鹽水中洗滌，洗凈血液，并向左心室中灌入Evans blue溶液2 mL、染色2 h，其中未染色區(qū)即為狹窄冠脈支配的缺血區(qū)，灌入2%瓊脂于4℃冷卻至凝固，并將心肌組織切成3 mm厚切片，2%TTC染色20 min，其中鮮紅色區(qū)域為未發(fā)生的壞死區(qū)域，未著色區(qū)為壞死區(qū)域，采用4%多聚甲醛固定24 h，然后采用Image J對心肌組織梗死區(qū)域、缺血危險區(qū)的面積進行計算。

1.2.5HE染色 4%多聚甲醛中固定心肌組織，常規(guī)石蠟包埋，切成4 μm，蘇木精、伊紅染色，中性樹膠封片，觀察心肌組織病理變化[7]。重復3次。

1.2.6氧化應激及炎性因子水平檢測 取0.5 g心肌組織，加入組織細胞裂解液、蛋白酶抑制劑，研磨成組織勻漿，3 000 r/min，離心20 min，取上清液，采用ELISA檢測心肌組織中MDA、SOD、IL-6、TNF-ɑ水平。重復3次。

1.2.7TUNEL檢測心肌組織凋亡 常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟，蛋白酶K修復20 min，3 % H2O2室溫5 min，PBS洗2次，TdT酶于37 ℃反應60 min，PBS洗3次，氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作溶液反應30 min，PBS洗4次，0.05% DAB顯色4 min，蒸餾水洗4次，蘇木精復染10 min，蒸餾水洗3次，脫水，透明，封片。每張片子選取5個視野，記錄陽性細胞數，取其均數作為該組陽性細胞數，陽性細胞表現為核黃色或者棕褐色顆粒。重復3次。

1.2.8Western blot檢測 取0.5 g心肌組織，蛋白提取試劑盒對各組大鼠心肌組織的總蛋白進行提取，Bradford蛋白定量，SDS-PAGE分離，將30 μg蛋白轉移至PVDF膜、室溫密封2 h，洗膜并加一抗(Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、GAPDH，1∶500)4℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗40 min，然后加入HRP標記二抗(1∶500)，37℃孵育2 h，ECL顯色，收集條帶影像。重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法處理實驗數據采用平均值±標準差的形式表示，one-way ANOVA檢驗組間差異有統(tǒng)計學意義時，兩兩組間的差異比較用LSD-t檢驗，SPSS 22.0軟件，檢驗水平ɑ=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠的血流動力學變化與假手術組相比，模型組的MAP、LVSP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax均降低(P<0.05)，LVEDP升高(P<0.05)；與模型組相比，RSV組、RSV+尿激酶原組的MAP、LVSP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax均升高(P<0.05)，LVEDP降低(P<0.05)；RSV組、RSV+尿激酶原組的MAP、LVSP、LVEDP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax比較差異不顯著(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的血流動力學變化

2.2 pro-UK聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌梗死及病理結構的影響假手術組大鼠的心肌組織細胞排列整齊、細胞結構完整、未出現明顯的病理變化，模型組大鼠心肌細胞出現炎性浸潤、壞死以及排列不規(guī)則，RSV組、RSV+尿激酶原組心肌細胞排列情況、細胞損傷情況、炎性浸潤較模型組明顯減輕，病理情況得到改善，見圖1。與模型組相比，RSV組、RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織相對梗死面積均降低(P<0.05)；RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織相對梗死面積低于RSV組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠的心肌相對梗死面積比較

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化(×200)

2.3 pro-UK聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌氧化應激與炎性因子水平的影響與假手術組相比，模型組的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平均升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；與模型組相比，RSV組、RSV+尿激酶原組的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平均降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)；與RSV組相比，RSV+尿激酶原組的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)。見表3。

表3 pro-UK聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌氧化應激與炎性因子水平的影響

2.4 pro-UK聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌組織凋亡的影響TUNEL檢測結果顯示，與模型組相比，RSV組、RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織凋亡率均降低(P<0.05)；RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織凋亡低于RSV組(P<0.05)，見圖2、表4。與假手術組相比，模型組Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組相比，RSV組、RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織中的Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)；與RSV組相比，RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織中的Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，見圖3、表5。

圖2 各組大鼠心肌組織TUNEL檢測結果(×200)

圖3 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3凝膠成像結果(×200)

表4 各組大鼠的心肌細胞凋亡率比較

表5 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3水平比較

3 討論

AMI是臨床缺血性疾病死亡原因之一，不但給患者帶來心理壓力，而且還會增加收治患者的經濟壓力[8-9]。RSV是一種具有調脂、非調脂作用的他汀類新型藥物，非調脂作用主要體現抗氧化、抗炎、抗心肌細胞肥大以及調控細胞凋亡、血管內皮細胞功能，能夠抑制AMI后的心室重構并且改善心室功能[10-11]。尿激酶原屬于絲氨酸蛋白酶類，分子約為49 kD，具有4個酶切位點，其本身的活性較低且在血漿中只有微弱活性，當到達血栓后，經纖溶酶激活后，部分可轉化為雙鏈UK，部分因結合在血栓表面致其構型發(fā)生改變轉化為纖溶酶，促進血栓纖維蛋白溶解[12-13]。本研究結果顯示，AMI大鼠的血流動力存在MAP、LVSP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax明顯升高趨勢，而LVEDP呈現出明顯降低趨勢，舒伐他汀、尿激酶原聯(lián)合RSV干預后可以明顯改善AMI大鼠的血流動力學情況。Yao等[14]認為重組尿激酶原對PPCI術后冠狀動脈血流的改善效果明顯，其療法與替羅非班具有相似安全性。由此推測，尿激酶原聯(lián)合RSV可以改善AMI大鼠的血流動力學情況。

AMI發(fā)生機制最早有血栓學說、炎癥學說、脂質浸潤及氧化應激學說等，由此表明AMI的發(fā)病機制較復雜[15-16]。本研究結果發(fā)現AMI模型組大鼠的心肌梗死面積增加，并且心肌組織細胞排列紊亂，細胞損傷嚴重，由此表明AMI大鼠心肌組織存在嚴重損傷。經RSV、尿激酶原聯(lián)合RSV干預后，AMI大鼠的心肌梗死面積降低，心肌組織細胞病理情況得到改善，并且尿激酶原聯(lián)合RSV干預后的改善情況更顯著。由此推測，尿激酶原聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌組織的改善作用可能與影響炎癥反應、氧化應激反應有關。本研究結果顯示AMI大鼠心肌組織中的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平升高，SOD活性降低，而RSV、尿激酶原聯(lián)合RSV干預后，心肌組織中的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平降低，SOD活性升高。MDA是脂質氧化產物，SOD可以清除自由基，單核細胞、成纖維細胞可合成分泌IL-6、TNF-ɑ，IL-6可誘導產生TNF-ɑ，加重機體炎癥反應。TNF-ɑ可以在衰竭心肌組織中表達，并且與臨床血流動力嚴重程度有關，TNF-ɑ高表達會促進心肌肥大、心室重塑以及心肌細胞凋亡[17]。已有研究[18]表明，RSV可以通過抑制IL-6、TNF-ɑ等炎性介質的釋放，從而降低AMI大鼠的心肌纖維程度，進而改善AMI大鼠的心室功能。有研究[19]顯示重組人尿激酶原聯(lián)合RSV可以降低AMI患者PCI術后炎性因子水平，改善患者預后。由此表明，尿激酶原聯(lián)合RSV可以調節(jié)AMI大鼠心肌組織氧化應激及炎性反應，但其作用機制還需要深入研究。

AMI可以引起心肌組織出現功能障礙，激活體內的神經內分泌系統(tǒng)，引起內源性的氧化物質水平增加，誘導體內凋亡途徑活化，從而促進心肌細胞發(fā)生凋亡、壞死。本研究結果顯示，模型組大鼠心肌細胞凋亡率顯著高于假手術組，而且心肌組織中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平檢測結果也表明模型組大鼠心肌組織中的Bcl-2蛋白水平降低，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平升高，由此表明AMI大鼠存在心肌組織凋亡損傷。RSV、尿激酶原聯(lián)合RSV干預之后，發(fā)現AMI大鼠的心肌細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白水平升高，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族中與細胞凋亡相關的重要成員，兩者結合后可形成異構二聚體或者是共同調節(jié)胞內鈣離子含量，參與細胞凋亡的調控作用[20-21]。Caspase-3位于凋亡級聯(lián)反應下游，是細胞凋亡通路的最終執(zhí)行者[22]。RSV可以有效抑制AMI大鼠的心肌細胞凋亡[23]，由此推測其作用機制可能與調節(jié)基因caspase-3表達量有關。

綜上所述，本文通過大鼠模型實驗證實RSV、尿激酶原聯(lián)合RSV均對AMI大鼠的心肌梗死面積、心肌組織凋亡情況、以及血流動力學具有改善作用，并且尿激酶原聯(lián)合RSV在心肌梗死面積、心肌組織凋亡方面的改善作用更顯著。本文的研究結果只表明尿激酶原聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌損傷有改善作用，但其中的具體作用機制、在臨床中是否也具有相似的效果還需要及進一步研究。