腎移植供者和受者HLA抗原頻率配合度回顧性研究分析

姜梅 魏金鳳 托婭

腎移植作為終末期腎病的有效治療手段，經(jīng)過多年的發(fā)展，在臨床上已經(jīng)得到很大的進步，伴隨著腎移植手術(shù)方法的不斷改進以及新型免疫抑制劑的面世，提高腎移植受者的遠期存活率成為臨床研究的重點方向。理想的人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA) 配型有益于移植腎長期存活已經(jīng)成為臨床共識，HLA錯配程度是刺激同種免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)。受體和供體的HLA不匹配引發(fā)的細胞和抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)成為影響器官移植生存期的主要免疫障礙[1]。由于HLA系統(tǒng)具有高度多態(tài)性，導(dǎo)致移植受者在尋找供腎時難度較大。本研究旨在通過研究腎移植供、受者HLA-A、B、DR、DQ抗原數(shù)據(jù)，了解HLA抗原的分布頻率，為移植受者的HLA配型提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 研究對象 入組對象為1 378例腎移植受者和102例供者，于2010年1月至2020年8月在解放軍聯(lián)勤保障部隊北戴河康復(fù)療養(yǎng)中心接受腎移植術(shù)前HLA-A、B、DR、DQ抗原檢測的腎移植受者，年齡18～60歲，男882例，女496例，均為首次移植。1.2 實驗儀器與試劑 DNA提取試劑和HLA分型試劑均由美國萊姆德公司生產(chǎn)。重組Taq聚合酶來自美國Immucor公司。運用特異性引物PCR技術(shù)(PCR sequence-specific，PCR-ssp) 進行HLA-A、B、DR、DQ抗原分型。

1.3 試驗方法 DNA提?。翰捎萌獦吮?，嚴格按照試劑操作說明書提取DNA，并測定DNA濃度和 純 度， 要 求DNA 濃 度 為25 ～200 ng/μL，A260/A280比例在1.65～1.80。

擴 增：①取 一 支D-Mix，加 入Taq 酶7 μL(5 U/μL)、待測標本DNA 111 μL，充分混勻。②將混勻后的樣本加入96孔板，每孔加入10 μL。③放入PCR儀進行擴增，擴增條件：96 ℃130 s，63 ℃60 s，1個循環(huán);96 ℃10 s，63℃60 s，9個循環(huán)；96 ℃10 s，59 ℃50 s，72 ℃30 s，20個循環(huán)，退火至4 ℃結(jié)束。

電泳：將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至2.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，150 V, 3～4 min。在暗箱式紫外燈下觀察結(jié)果，采用試劑公司提供的軟件分析HLA結(jié)果。將所有入組病例結(jié)果錄入Excel表格行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 腎移植受者及供者HLA-A抗原分布頻率

受者HLA-A抗原共出現(xiàn)19種。其中A2抗原出現(xiàn)頻率最高，達27%；其次為A11，A24抗原，分別為20%和17.8%；現(xiàn)頻率最低的有A28、A66、A80(均為0.07%)。供者HLA-A共有12種，其中A2出現(xiàn)頻率最高，達32.4%，其次為A11、A24，分別為16.7%和18.6% ；A23 和A29 出 現(xiàn) 頻 率 最 低( 均 為1.5%)。供受者HLA-A 抗原出現(xiàn)頻率，見表1。

表1 供受者HLA-A抗原出現(xiàn)頻率[n(%)]

2.2 腎移植受者及供者HLA-B抗原分布頻率本組病例中，受者HLA-B抗原共出現(xiàn)42種，分布頻率最高的是B13 (13.4%)，分布頻率最低的是B17、B24、B76(均為0.07%)。

供者HLA-B抗原共有25種，其中出現(xiàn)頻率最高的是B13(12.7%)，最低的是B67和B56、B49(均為0.5%)。供受者HLA-B抗原頻率，見表2。

表2 供受者HLA-B抗原頻率[n(%)]

續(xù)表2 供受者HLA-B抗原頻率[n(%)]

2.3 腎移植受者及供者HLA-DR抗原分布頻率受者HLA-DR共有16種，DR15抗原分布頻率最高(24.0%)；分布頻率最低的是DR18(0.6%)。

供 者HLA-DR 共 有14 種，分 別 為DR1、DR3、DR4、DR7、DR8、DR9、DR10、DR11、DR12、DR13、DR14、DR15、DR16、DR17。DR9抗原分布頻率最高(18.6%)；分布頻率最低的是DR10(0.5%)。供者中未檢出DR6和DR18。供受者HLA-DR抗原分布頻率，見表3。

表3 HLA-DR抗原分布頻率[n(%)]

2.4 腎移植受者及供者HLA-DQ抗原分布頻率受者和供者中HLA-DQ均出現(xiàn)7種，受者出現(xiàn)頻率最高的是DQ6 (21.7%)，頻率最低的是DQ8(5.2%)；供者出現(xiàn)頻率最高的是DQ7(25%)，最低的是DQ8(4.4%)。HLA-DQ抗原頻率，見表4。

表4 HLA-DQ抗原分布頻率[n(%)]

3 討論

HLA基因位于第六號染色體的短臂上，是人類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的表達產(chǎn)物，在免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)異體移植排斥作用中起到重要作用。HLA錯配程度是刺激同種免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，研究認為由于HLA錯配而產(chǎn)生的新生供者特異性抗體(dnDSA)是目前影響移植器官長期存活的主要因素[2-4]。HLA抗原配型的相合程度對于避免移植后供者特異性抗體的產(chǎn)生、降低排斥反應(yīng)的發(fā)生概率有著積極作用[5]，對腎移植術(shù)后遠期生存率有著較大影響[6-7]。因此尋找HLA匹配的供腎是臨床醫(yī)生和移植患者的共同愿望。然而由于HLA是具有高度復(fù)雜多態(tài)性的人類基因系統(tǒng)，尋找HLA高度相合的供腎并不容易，國外大型的腎移植中心能夠達到HLA抗原完全無錯配也不到8%[8]。因此，了解HLA抗原分布頻率，對于腎移植受者尋找理想的供腎有著積極意義。

本組研究中供、受者HLA-A抗原出現(xiàn)頻率最高的均為A2 抗原，其次為A11 和A24，提示在HLA-A抗原組中具有A2、A11、A24的受者更容易找到相匹配的供體，這與馬錫慧等[9]和Arnaiz-Villena等[10]的研究相同，但Pei Y等[11]的研究結(jié)果認為A11的分布頻率最高。這應(yīng)該和研究者所采用樣本人群的地域、人種、民族有關(guān)。研究表明[12]黃種人未發(fā)現(xiàn)A34、A66和A74，而本組數(shù)據(jù)顯示黃種人也存在A34、A66和A74。

HLA-A、B抗原與移植排斥有著密切關(guān)系，當慢性移植腎功能減退或慢性移植腎功能喪失時，多數(shù)伴隨HLA-I類抗體升高[13]。因此尋找HLA-A、B抗原相匹配的供腎對移植受者的長期生存、降低排斥反應(yīng)的發(fā)生概率有著重要意義。本組受者中發(fā)現(xiàn)HLA-B抗原有46種，供、受者組HLA-B出現(xiàn)頻率最高的均為B13，出現(xiàn)頻率最低的并不相同，顯示了HLA-B抗原的多態(tài)性。供者HLA-B只檢出26種，這與供者樣本量小有關(guān)，也反映出供體的缺乏。由于HLA-B抗原的多態(tài)性，以及供者的數(shù)量不足使受者更難找到HLA-B抗原匹配的供腎。

早期研究即已表明，HLA-DR抗原與腎移植后早期排斥反應(yīng)的發(fā)生率、以及排斥反應(yīng)的嚴重程度有關(guān)[13]。受者HLA-DR通過將供者HLA短肽呈遞給輔助性T細胞，誘導(dǎo)B細胞分化為漿細胞，進而導(dǎo)致dnDSA的產(chǎn)生，受者體內(nèi)dnDSA本組病例中受者和供者出現(xiàn)頻率最高的均為DR15。受者中出現(xiàn)頻率最低的是DR18，供者中未檢出DR18，從一定程度上說明DR18在本地區(qū)人群中分布頻率不高。

隨著研究的深入，HLA-DQ在移植免疫中的作用越來越得到重視，王婷等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，在移植后產(chǎn)生的dnDSA的受者中，73%是抗HLA-DQ的dnDSA，是影響移植腎長期存活的獨立危險因素。本組數(shù)據(jù)中供、受者HLA-DQ出現(xiàn)的種類相同，但出現(xiàn)頻率最高的并不相同，表明HLA-DQ的種類雖不多，但由于供體緊缺以及HLA的基因多態(tài)性，尋找匹配的供腎仍然存在難度。供、受者HLA基因分布頻率的不同是否與腎臟疾病的發(fā)生有關(guān)還有待進一步研究。

本研究的不足之處在于樣本量不夠大，尤其是供者數(shù)量少，并且患者均來自本省及相鄰地區(qū)，受到民族和地域的影響，因此在研究結(jié)果上存在局限性。我國目前實行公民逝世后自愿捐獻器官的政策，雖然已經(jīng)在社會各界的支持下取得了巨大進步[15]但仍需要進行大力宣傳以提高公民對于逝世后器官捐獻的認知度，擴大供腎來源，才能使移植受者有更多的機會尋找HLA抗原相容度高的供體。正在發(fā)展中的HLA分子配型比目前采用的HLA抗原配型更為精準，它通過分析結(jié)構(gòu)表位、氨基酸和靜電等錯配特征，有希望為移植等待者找到更匹配的供腎。