生肌膏對(duì)大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用及其可能機(jī)制▲

羅澤琴 田興中 張曉飛 司華清

(河北省張家口市第五醫(yī)院肛腸科，張家口市 075000，電子郵箱：lzq32156@163.com)

肛周膿腫是由細(xì)菌感染引發(fā)的急性或慢性化膿性疾病，其發(fā)病部位包括肛門、肛管及直腸周圍軟組織[1]。肛周膿腫主要表現(xiàn)為肛門灼熱、排便疼痛等，若治療不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作，甚至發(fā)生感染性休克，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。目前，肛周膿腫的主要治療手段為膿腫切開引流術(shù)，但由于病變位置特殊,患者術(shù)后創(chuàng)面愈合緩慢[3]，因此，迫切需要尋找有效的藥物以促進(jìn)肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面的愈合。研究表明，Notch1信號(hào)通路能夠促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖，在促進(jìn)皮膚傷口愈合和組織修復(fù)中起至關(guān)重要的作用[4]。生肌膏在臨床上主要用于慢性創(chuàng)面愈合，可促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)，效果顯著[5]，但其促進(jìn)肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的效果及作用機(jī)制是否與Notch1信號(hào)通路相關(guān)尚不明確。本研究通過建立肛周膿腫大鼠術(shù)后創(chuàng)面模型，探討生肌膏促進(jìn)肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的效果及作用機(jī)制，以期為肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無(wú)特定病原體級(jí)SD大鼠65只，8周齡，體重(200.0±10.0)g，均為雌性，購(gòu)自上海劍鈍生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2019-0027。經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵守3R保護(hù)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要藥品與試劑：生肌膏由本院藥房自制，主要成分有生血余60 g、爐甘石250 g、象皮90 g、生地黃120 g、當(dāng)歸60 g、生石膏150 g、龜甲120 g；Masson三色染色試劑盒(批號(hào)：G1340)、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)試劑盒(批號(hào)：G1120)、RIPA裂解液(批號(hào)：R0010)、ECL發(fā)光液(批號(hào)：PE0010)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(批號(hào)：SEKH-0047)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1α ELISA試劑盒(批號(hào)：SEKH-0001)、IL-6 ELISA試劑盒(批號(hào)：SEKH-0013)均購(gòu)自北京Solarbio公司；Notch1兔抗大鼠多克隆抗體(批號(hào)：PA5-95827)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)兔抗大鼠多克隆抗體(批號(hào)：PA1-183)和山羊抗兔lgG(H+L)二級(jí)抗體(批號(hào)：A32731)均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3 主要儀器：CX41生物顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；Gel DocTMXR+型凝膠成像儀和T100型PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備：參考文獻(xiàn)[6]制備肛周膿腫大鼠術(shù)后創(chuàng)面模型。使用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)選取45只大鼠，采用1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進(jìn)行麻醉后固定于操作臺(tái)，碘附常規(guī)消毒，局部備皮，在大鼠背部取直徑為1.5 cm的創(chuàng)面?zhèn)冢钪良?，止血后滴?.0 mL糞液(正常人新鮮糞便20 g溶解于10 mL生理鹽水，5 000 r/min離心10 min后取上清液)，用醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面，固定48 h，于(60.0±5.0)%濕度、光照與黑暗每12 h交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，創(chuàng)口出現(xiàn)膿性分泌物，有糞臭味即為建模成功。本研究建模成功40只大鼠，經(jīng)手術(shù)清除膿腫，生理鹽水清洗，紗布覆蓋48 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及創(chuàng)面處理：將40只建模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為模型組(n=20)和生肌膏治療組(n=20)。肛周膿腫術(shù)后48 h，每天清晨在創(chuàng)生肌膏治療組大鼠面滴加人新鮮糞液0.5 mL，30 min后用生理鹽水清洗，碘附消毒并外涂厚度約為1 mm生肌膏完全覆蓋創(chuàng)面，更換紗布，持續(xù)18 d。模型組大鼠每天在相同時(shí)間、相同方法給予術(shù)后創(chuàng)面滴加糞液、清洗并消毒，更換紗布，但不給予藥物處理，持續(xù)18 d。取剩余20只大鼠按照1.2.1方法僅在大鼠背部行直徑為1.5 cm的創(chuàng)面?zhèn)?，未滴加糞液，每天在相同時(shí)間滴加生理鹽水0.5 mL，消毒后更換紗布，設(shè)置為對(duì)照組。

1.2.3 創(chuàng)面形態(tài)學(xué)觀察：于每次換藥或更換紗布時(shí)，按隨機(jī)數(shù)字法選取各組10只大鼠觀察術(shù)后創(chuàng)面組織的腫脹程度、組織生長(zhǎng)狀態(tài)等，估算大鼠在創(chuàng)面處理前(切除膿腫48 h后即刻)以及創(chuàng)面處理后3 d、8 d、13 d和18 d的創(chuàng)面面積，計(jì)算愈合率。愈合率=[(切除膿腫48 h時(shí)的創(chuàng)面面積-觀察時(shí)的創(chuàng)面面積)/建模成功時(shí)的創(chuàng)面面積]×100%。

1.2.4 Masson染色實(shí)驗(yàn)：分別于創(chuàng)面處理后3 d、13 d，按隨機(jī)數(shù)字法處死各組大鼠5只，取大鼠肛周膿腫術(shù)后愈合組織，行石蠟包埋、切片，根據(jù)Masson試劑盒說(shuō)明書對(duì)組織切片進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察組織病理狀態(tài)。生肌膏處理后18 d，處死各組剩余大鼠，按照上述方法獲取各組肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合組織，一部分用于制作切片，作Masson染色用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將其余組織置于-80℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 HE染色觀察大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合組織表皮生長(zhǎng)情況：選取1.2.4中各時(shí)間點(diǎn)的大鼠愈合組織切片，經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞變化情況。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Notch1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平：取1.2.4中-80℃保存的各組大鼠創(chuàng)面組織90 mg，解凍勻漿后，4℃下10 000 r/min離心10 min取上清液，使用RNeasy Mini Kit(上海北諾生物科技有限公司，批號(hào)：74106)提取各組總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上?？泼羯锟萍加邢薰荆?hào)：205311)，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(PCR試劑盒購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司，批號(hào)：QP-01011)，以β-actin為內(nèi)參，測(cè)定Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。Notch1 mRNA和β-actin引物序列均由生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。反應(yīng)體系共24 μL；反應(yīng)條件：50℃、2 min，95℃、10 min，95℃、15 s，40個(gè)循環(huán)，60℃、1 min退火。以2-ΔΔCt計(jì)算Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 Notch1和β-actin引物序列

1.2.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量：取1.2.4中-80℃保存的各組大鼠創(chuàng)面組織30 mg，制備勻漿液，使用RIPA裂解液提取各組組織總蛋白，二喹啉甲酸法檢測(cè)蛋白總量，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、TBST清洗后，依次加入一抗Notch1(1∶800)和β-actin(1∶1 000)，低溫過夜，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST清洗后，曝光顯影，采用Gel DocTMXR+型凝膠成像儀分析各組條帶，Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量=Notch1條帶灰度值/β-actin灰度值。

1.2.8 ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平：取1.2.4中-80℃保存的各組大鼠創(chuàng)面組織0.05 g，制備勻漿液，根據(jù)TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)各組肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面形態(tài)學(xué)及創(chuàng)面愈合率的比較 創(chuàng)面處理后3、8、13和18 d，3組大鼠的創(chuàng)面愈合率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中創(chuàng)面處理后3、8、13和18 d，3組大鼠創(chuàng)面愈合率由高到低均為生肌膏治療組、對(duì)照組、模型組(均P<0.05)。創(chuàng)面處理后3、8、13和18 d，與對(duì)照組相比，模型組創(chuàng)口愈合緩慢；與模型組相比，生肌膏治療組大鼠創(chuàng)口愈合情況明顯增加，創(chuàng)口減小，且愈合效果優(yōu)于對(duì)照組。見圖1和表2。

建模成功時(shí) 創(chuàng)面處理后3 d 創(chuàng)面處理后8 d 創(chuàng)面處理13 d 創(chuàng)面處理第18天

表2 不同時(shí)間點(diǎn)3組大鼠創(chuàng)面愈合率的比較(x±s，%)

2.2 3組大鼠的創(chuàng)面組織學(xué)變化 Masson染色法結(jié)果顯示：隨時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織的膠原纖維合成數(shù)量呈增加趨勢(shì)；相同時(shí)間點(diǎn)，模型組膠原蛋白的形成速率最慢、數(shù)量最少，生肌膏治療組的膠原纖維合成數(shù)量最多，對(duì)照組次之。見圖2。HE染色結(jié)果提示：隨時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織表皮生長(zhǎng)狀態(tài)逐步改善，表皮厚度逐漸增加；同一時(shí)間點(diǎn)，模型組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織表皮生長(zhǎng)狀態(tài)最差，表皮厚度最?。簧「嘀委熃M大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織表皮厚度明顯增加，表皮組織形態(tài)明顯完善，對(duì)照組介于模型組和生肌膏治療組之間。見圖3。

圖2 3組大鼠創(chuàng)面愈合組織學(xué)變化(Masson染色，×200)

圖3 3組大鼠創(chuàng)面組織HE染色結(jié)果(×200)

2.3 3組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織Notch1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較 3組大鼠創(chuàng)面組織的Notch1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中生肌膏治療組、對(duì)照組、模型組大鼠創(chuàng)面組織的Notch1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平均依次降低(均P<0.05)。見圖4和表3。

圖4 3組大鼠創(chuàng)面組織中Notch1蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 3組大鼠創(chuàng)面組織Notch1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.4 3組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平的比較 3組大鼠創(chuàng)面的TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中模型組、對(duì)照組、生肌膏治療組大鼠創(chuàng)面組織的TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平均依次降低(均P<0.05)。見表4。

表4 3組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平的比較(x±s，pg/mL)

3 討 論

肛周膿腫屬于臨床常見肛腸科疾病，主要由葡萄糖球菌、大腸桿菌、鏈球菌或其他厭氧細(xì)菌感染引起[7]。手術(shù)治療肛周膿腫后創(chuàng)面容易發(fā)生水腫、疼痛和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高，而有效的術(shù)后藥物治療是肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵[8]。南宋時(shí)期，《外科精要》記載“治谷道前后生癰,謂之懸癰”，將肛周膿腫命名為“懸癰”；至清代《醫(yī)門補(bǔ)要》中提出“肛癰”病名，一直被后代醫(yī)家沿用至今[9]。生肌膏是中醫(yī)常用的傷口愈合治療藥方之一，包含當(dāng)歸、甘草、白芷、紫草和血竭等重要成分，具有很好的臨床療效[10]。李志等[11]研究發(fā)現(xiàn)，濕潤(rùn)生肌膏能夠促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)口肉芽組織形成，加快傷口愈合；賈湘隆等[12]的研究表明，回陽(yáng)生肌膏對(duì)糖尿病大鼠陰證瘡面愈合具有促進(jìn)作用；此外，還有研究表明清熱生肌膏可保護(hù)Ⅱ度燒傷大鼠傷口愈合[13]。本研究結(jié)果顯示，給予生肌膏治療后，生肌膏治療組大鼠肛周膿腫創(chuàng)面愈合率高于模型組(均P<0.05)，提示生肌膏對(duì)肛周膿腫創(chuàng)面愈合具有促進(jìn)作用。Masson和HE染色結(jié)果顯示，采用生肌膏治療后，生肌膏治療組大鼠創(chuàng)面組織中膠原形成情況和表皮生長(zhǎng)速率均優(yōu)于模型組，表明生肌膏有助于肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面中的膠原重塑和表皮生長(zhǎng)，從而促進(jìn)肛周膿腫術(shù)后的創(chuàng)面愈合。

Notch1信號(hào)通路是一類高度保守的信號(hào)途徑，參與各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[14-15]。近年來(lái)，越來(lái)越多研究證實(shí)，Notch1基因的激活可能與皮膚傷口愈合密切相關(guān)[16-18]。Na等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Notch1在皮膚傷口邊緣表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)減少或失活均不利于皮膚傷口愈合；而激活Notch1途徑或可通過促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進(jìn)皮膚傷口愈合[17]。此外，堿性成纖維生長(zhǎng)因子可以通過上調(diào)Notch1蛋白表達(dá)，改善傷口愈合質(zhì)量并減輕疤痕[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織Notch1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(均P<0.05)，提示Notch1表達(dá)下調(diào)可能與大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合不佳相關(guān)；而生肌膏治療組大鼠的肛周膿腫創(chuàng)面組織Notch1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于模型組，提示生肌膏可能通過激活Notch1信號(hào)通路，加速肛周膿腫大鼠術(shù)后傷口的愈合。

創(chuàng)面組織中的炎癥反應(yīng)對(duì)于對(duì)感染的發(fā)生具有重要影響，其會(huì)導(dǎo)致的傷口難以愈合或產(chǎn)生疤痕[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的創(chuàng)面組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，提示在肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合過程中，創(chuàng)面愈合組織中存在炎癥反應(yīng)；而與模型組相比，生肌膏治療組大鼠創(chuàng)面組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平均降低(均P<0.05)，提示生肌膏對(duì)肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用，可能與降低炎癥因子表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，生肌膏可能通過激活Notch1信號(hào)通路、減輕創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面的愈合。這表明生肌膏對(duì)肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面具有潛在的治療價(jià)值，但臨床肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合受環(huán)境影響較大，且易被細(xì)菌感染，因此生肌膏對(duì)該疾病的治療效果及作用機(jī)制有待更深入的研究以證實(shí)。