西格列汀對(duì)小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷的治療作用

張遠(yuǎn)洋 王梅芳 董銀萍 吳靜 王欣悅 李文璇 李德冠

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300192

隨著社會(huì)與科技的進(jìn)步，核技術(shù)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和軍事等領(lǐng)域。電離輻射會(huì)對(duì)機(jī)體造成急性、慢性或持久性損傷。造血系統(tǒng)因其對(duì)輻射的敏感性使其在輻射損傷的治療中起著重要作用。造血生長(zhǎng)因子（例如粒細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）目前已獲得美國(guó)食品和藥物管理局的批準(zhǔn)用于治療造血系統(tǒng)的輻射損傷[1]。然而，應(yīng)用造血生長(zhǎng)因子不僅會(huì)導(dǎo)致發(fā)燒、疼痛和嘔吐等，而且會(huì)破壞造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSC）的自我更新能力，從而加速HSC的耗竭并進(jìn)一步影響造血系統(tǒng)的長(zhǎng)期恢復(fù)。因此，造血系統(tǒng)輻射損傷的治療方法研究仍需進(jìn)一步開展。

西格列?。╯itagliptin）是廣泛用于臨床治療2型糖尿病的藥物[2-4]。前期研究結(jié)果表明，西格列汀可以降低急性胰腺炎、糖尿病心肌病、慢性腦灌注不足、心力衰竭和肝缺血再灌注等疾病中的氧化應(yīng)激水平[5-9]。Broxmeyer 等[10]發(fā)現(xiàn)，提前給予小鼠西格列汀或敲除二肽基肽酶4（DPP4），可增強(qiáng)輻射暴露后機(jī)體的造血能力恢復(fù)。然而，西格列汀在造血系統(tǒng)輻射損傷中的治療效果和機(jī)制尚待研究。

本研究在觀察西格列汀對(duì)正常小鼠外周血血象是否有影響的基礎(chǔ)上，探究了西格列汀在小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷中的治療效果，為尋找造血系統(tǒng)輻射損傷的潛在治療藥物研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6 純系小鼠，6～8 周齡，雄性，體重20～22 g，購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0003。小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所無(wú)特定病原體級(jí)動(dòng)物房，自由飲用無(wú)菌水和進(jìn)食無(wú)特定病原體級(jí)鼠繁殖飼料，飼養(yǎng)溫度 18～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2 主要儀器與試劑

Gammacell?40 Exactor137Cs γ 射線照射源購(gòu)自加拿大Best Theratronics 公司，劑量率為1.01 Gy/min；MEK-7222K 全自動(dòng)血液分析儀購(gòu)自日本光電工業(yè)株式會(huì)社；Accuric 6 型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。西格列汀購(gòu)自美國(guó)默沙東公司。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。2′,7′-二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甲基纖維素培養(yǎng)基M3534 購(gòu)自加拿大Stem Cell Technologies 公司；一抗和二抗購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司和Biolegend 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥

本課題組前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，西格列汀單獨(dú)給藥組各項(xiàng)指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，在本研究中，僅設(shè)置對(duì)照組。將15 只C57BL/6 雄性小鼠按照區(qū)組隨機(jī)法分為對(duì)照組、照射組和西格列汀+照射組，每組5 只。照射組和西格列汀+照射組小鼠均接受7 Gy137Cs γ 射線一次性全身照射。西格列汀+照射組于照射后2 h開始灌胃給藥，給藥劑量為10 mg/kg，每只0.2 mL，連續(xù)給藥7 d，對(duì)照組和照射組給予等量生理鹽水。照射后第30 天頸椎脫位法處死小鼠，進(jìn)行相關(guān)分析。

1.3.2 外周血血象的分析

小鼠眼靜脈叢取外周血，滴入到含有抗凝劑的EP 管中，用血液分析儀測(cè)定WBC、RBC、血小板（platelet, PLT）計(jì)數(shù)和血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、紅細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）水平等指標(biāo)。

1.3.3 骨髓有核細(xì)胞（bone marrow nucleated cell，BMNC）計(jì)數(shù)

無(wú)菌條件下取小鼠單側(cè)股骨，用含2%胎牛血清的PBS 沖洗后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.4 骨髓細(xì)胞分型的檢測(cè)

取1×106個(gè)骨髓細(xì)胞，加入biotin 標(biāo)記的混合一抗（CD4、CD8、Ter119、CD11b、CD45R/B220和Gr-1），4℃避光孵育30 min，洗滌1 次后棄上清，加入混合二抗（streptavidin-Percp、Sca1-PE 和c-kit-APC）染色，4℃避光孵育30 min，洗滌1 次后棄上清，重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cell, HPC）（lin?ckit+Sca1?）和HSC（lin?c-kit+Sca1+）的百分比及數(shù)量。

1.3.5 骨髓細(xì)胞克隆形成能力的檢測(cè)

取骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，加入至甲基纖維素培養(yǎng)基M3534 中后緩慢接種到24 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6 個(gè)平行孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)5 d 后，計(jì)數(shù)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位（colony-forming units granulocyte-macrophage，CFU-GM）的克隆數(shù)，以≥50 個(gè)細(xì)胞群為陽(yáng)性克隆，結(jié)果以每105個(gè)骨髓細(xì)胞生成的CFU-GM 克隆數(shù)表示。

1.3.6 活性氧的檢測(cè)

將骨髓細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，平均熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞中活性氧水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2 組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（方差齊）。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西格列汀對(duì)照射后小鼠BMNC 及外周血血象的影響

由表1 可知，與對(duì)照組相比，照射組小鼠BMNC、外周血WBC、RBC、PLT 計(jì)數(shù)和HGB、HCT 水平均顯著減少、降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.476～12.200，均P<0.05）；與照射組相比，西格列汀+照射組小鼠的BMNC 和WBC 計(jì)數(shù)均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。以上結(jié)果提示西格列汀可促進(jìn)輻射暴露后的骨髓細(xì)胞及外周血的恢復(fù)。

表1 西格列汀對(duì)7 Gy γ 射線全身照射后小鼠外周血血象及骨髓有核細(xì)胞的影響（ ±s）Table 1 Effect of sitagliptin on peripheral blood hemogram and bone marrow nucleated cells of mice exposed to 7 Gy γ-ray whole-body irradiation ( ±s)

表1 西格列汀對(duì)7 Gy γ 射線全身照射后小鼠外周血血象及骨髓有核細(xì)胞的影響（ ±s）Table 1 Effect of sitagliptin on peripheral blood hemogram and bone marrow nucleated cells of mice exposed to 7 Gy γ-ray whole-body irradiation ( ±s)

注：表中，a 表示與對(duì)照組比較，t=2.510～12.200，均P<0.05；b 表示與照射組比較，t=4.593、7.020，均P<0.05

紅細(xì)胞比容（%）對(duì)照組（n=5） 20.5±2.2 11.7±2.2 9.2±0.4 443.6±68.4 131.0±5.8 31.2±1.2照射組（n=5） 8.0±1.0a 3.0±0.2a 7.9±0.6a 213.3±48.3a 117.6±6.4a 28.3±1.4a西格列汀+照射組（n=5） 11.0±0.4ab 3.9±0.3ab 7.4±0.7a 362.0±66.7a 110.0±10.4a 26.8±2.0a組別 骨髓有核細(xì)胞（×106個(gè)）白細(xì)胞（×109個(gè)/L）紅細(xì)胞（×1012個(gè)/L）血小板（×109個(gè)/L）血紅蛋白（g/L）

2.2 西格列汀對(duì)照射后小鼠HSC 和HPC 的影響

由圖1 可見，與對(duì)照組相比，照射組小鼠HSC和HPC 的數(shù)量、百分比均顯著減少、降低（均P<0.05），這表明電離輻射對(duì)HSC 和HPC 有一定的損傷作用；與照射組相比，西格列汀+照射組小鼠HPC 的數(shù)量[（33 724.4±10 594.9）個(gè)對(duì)（101 637.6±17 240.5）個(gè)]、百分比[（5.6±1.0）%對(duì)（11.5±3.0）%]均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。以上結(jié)果表明，西格列汀可緩解受照小鼠HPC 和HSC 的損傷，對(duì)輻射所致造血功能損傷有一定的治療效果。

圖1 西格列汀對(duì)7 Gy γ 射線全身照射后小鼠HPC 和HSC 百分比及數(shù)量的影響 a 表示與對(duì)照組比較，t=3.174～5.287，均P<0.05；b 表示與照射組比較，t=4.163、5.951，均P<0.05。HPC 為造血祖細(xì)胞；HSC 為造血干細(xì)胞Figure 1 Effect of sitagliptin on the percentage and number of hematopoietic progenitor cells and hematopoietic stem cells of mice exposed to 7 Gy γ-ray whole-body irradiation

2.3 西格列汀對(duì)照射后小鼠骨髓細(xì)胞增殖功能的影響

與對(duì)照組相比，照射組、西格列汀+照射組小鼠骨髓細(xì)胞CFU-GM 均顯著減少，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.240、9.436，均P<0.05）；與照射組相比，西格列汀+照射組小鼠骨髓細(xì)胞CFU-GM 增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.964，P<0.05）（CFUGM：對(duì)照組66.2±5.3、照射組30.8±3.9、西格列汀+照射組38.2±4.4）。以上結(jié)果表明，西格列汀治療可提高7 Gy 照射小鼠骨髓細(xì)胞的克隆形成能力，一定程度上能夠恢復(fù)骨髓細(xì)胞的增殖功能。

2.4 西格列汀對(duì)照射后小鼠造血細(xì)胞活性氧水平的影響

由圖2 可見，與對(duì)照組相比，照射組小鼠在受照后第30 天HSC 中的活性氧水平顯著升高（P<0.05）；與照射組相比，西格列汀+照射組小鼠HSC 中的活性氧水平顯著降低（P<0.05）（HSC 中的活性氧水平：對(duì)照組1980.6±309.3、照射組3994.5±1119.0、西格列汀+照射組2415.7±122.9）。這些結(jié)果提示西格列汀對(duì)電離輻射所致的造血系統(tǒng)輻射損傷的保護(hù)作用可能是通過(guò)降低HSC 中活性氧水平實(shí)現(xiàn)的。

圖2 西格列汀對(duì)7 Gy γ 射線全身照射后小鼠BMNC、HPC 和HSC 中活性氧水平的影響 a 表示與對(duì)照組比較，t=3.904，P<0.05；b 表示與照射組比較，t=2.375，P<0.05。BMNC 為骨髓有核細(xì)胞；MFI 為平均熒光強(qiáng)度；HPC 為造血祖細(xì)胞；HSC 為造血干細(xì)胞Figure 2 Effect of sitagliptin on the levels of reactive oxygen species in bone marrow nucleated cell, hematopoietic progenitor cell and hematopoietic stem cell of mice exposed to 7 Gy γ-ray whole-body irradiation

3 討論

輻射防護(hù)“老藥”的藥代動(dòng)力學(xué)及安全性資料已知，其新用途的開發(fā)可以大大節(jié)約研發(fā)周期和成本，被認(rèn)為是新藥開發(fā)中最有效、最快捷的策略之一[11]。西格列汀可抑制腸促胰島激素（如胰高血糖素樣肽-1）和葡萄糖依賴性促胰島素多肽的降解，進(jìn)而治療糖尿病。近年來(lái)，有研究者發(fā)現(xiàn)西格列汀還具有抗氧化和消炎的作用，在動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥性腸病、心力衰竭和血管炎癥等疾病中起作用[5,12-13]。提前給予小鼠西格列汀，結(jié)果證實(shí)西格列汀可增強(qiáng)輻射暴露后機(jī)體的造血能力恢復(fù)[10]。而本研究在前期觀察西格列汀對(duì)正常小鼠血象無(wú)顯著影響的基礎(chǔ)上，在小鼠接受7 Gy 照射后給予西格列汀，以觀察西格列汀對(duì)造血系統(tǒng)輻射損傷的治療作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

我們前期利用C57/BL6 小鼠研究不同劑量137Cs γ 射線照射對(duì)HSC 和HPC 的影響，發(fā)現(xiàn)小鼠血細(xì)胞、HSC、HPC 數(shù)量隨照射劑量的增加而降低[14]；本課題組前期觀察了西格列汀對(duì)4 Gy 輻射損傷的治療作用[15]，本研究觀察了西格列汀對(duì)7 Gy 亞致死劑量輻射損傷小鼠的治療效果。造血系統(tǒng)對(duì)輻射高度敏感[16-17]，成年個(gè)體造血功能主要由骨髓承擔(dān)，BMNC 數(shù)量可在一定程度上反映骨髓造血能力[18-19]。本研究結(jié)果表明，西格列汀可顯著提高7 Gy受照小鼠的骨髓細(xì)胞和外周血WBC，這提示西格列汀對(duì)造血系統(tǒng)輻射損傷具有治療作用。造血系統(tǒng)輻射損傷后發(fā)生功能障礙的原因之一是維持造血功能的HSC 和HPC 受到損傷。HSC 是一類具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，電離輻射可以引起HSC 損傷，導(dǎo)致其數(shù)量減少，自我更新能力降低，導(dǎo)致骨髓的長(zhǎng)期損傷[20-21]。在本研究中，我們使用流式細(xì)胞儀觀察了HSC 和HPC 數(shù)量的變化，結(jié)果表明，西格列汀可顯著增加受照小鼠中HPC和HSC 的數(shù)量；進(jìn)一步采用克隆集落形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估骨髓細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果表明西格列汀還可以促進(jìn)造血細(xì)胞增殖能力的恢復(fù)。以上結(jié)果提示，西格列汀能有效治療造血系統(tǒng)因輻射引起的損傷。

輻射引起的氧化應(yīng)激是輻射損傷的重要原因。電離輻射會(huì)直接作用于水分子使其分解，導(dǎo)致大量細(xì)胞源性自由基的產(chǎn)生，過(guò)量的活性氧可引起生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 的氧化，造成生物膜損傷，從而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。我們?cè)谥暗膶?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)小鼠BMNC、HPC 和HSC 在接受6.5 Gy 照射后細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平均有先升高后降低的趨勢(shì)，在第28～56 天，HSC 的活性氧水平仍很高，HPC 和BMNC 的活性氧水平已經(jīng)恢復(fù)正常[16]。在本研究中，我們觀察了接受7 Gy 照射后第30 天的小鼠BMNC、HPC 和HSC 中活性氧水平，發(fā)現(xiàn)HSC 中活性氧水平顯著提升，而在其他兩種細(xì)胞中不明顯，這與前期的研究結(jié)果一致。而本研究結(jié)果顯示，西格列汀治療可降低受照小鼠HSC 中活性氧水平，這提示西格列汀可通過(guò)調(diào)節(jié)HSC 中活性氧水平來(lái)達(dá)到治療造血系統(tǒng)輻射損傷的效果。

總之，本研究結(jié)果表明，西格列汀對(duì)造血系統(tǒng)輻射損傷具有治療作用，可能主要是通過(guò)降低造血細(xì)胞活性氧水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而，其輻射防護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制和最佳用法、用量等仍有待進(jìn)一步探究。同時(shí)，積極開發(fā)輻射防護(hù)“老藥”的新用途，為探索治療電離輻射損傷作用的高效途徑和開展對(duì)抗輻射的研究具有重要意義。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明 張遠(yuǎn)洋、王梅芳負(fù)責(zé)現(xiàn)場(chǎng)的取材及實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)的收集及整理、論文的撰寫；董銀萍、吳靜負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)方法的建立；王欣悅、李文璇負(fù)責(zé)現(xiàn)場(chǎng)的取材及實(shí)驗(yàn)；李德冠負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與實(shí)施、論文的審閱。