基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡藥理學研究慢性阻塞性肺疾病的中藥用藥規(guī)律及機制

吳 凡， 李澤庚， 董昌武， 朱 潔， 王小樂， 高雅婷， 楊勤軍

(1.安徽中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學院中醫(yī)呼吸病防治研究所，安徽 合肥 230038；3.安徽省教育廳重點實驗室中醫(yī)藥防治肺系重大疾病重點實驗室，安徽 合肥 230038)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持續(xù)存在的呼吸道癥狀和氣流受限為特征的一種常見疾病,與有害顆?；驓怏w的顯著暴露和(或)肺泡異常相關(guān)[1],具有患病率、病死率、致殘率高的特點[2]。目前西醫(yī)治療COPD的方案包括抗感染、抗炎、擴張支氣管等，并不能有效控制進行性發(fā)展的氣道炎癥和逆轉(zhuǎn)肺功能下降[3]；中醫(yī)防治COPD有顯著的療效，通過辨證論治，能夠有效控制癥狀，延緩疾病進程，提高患者生活質(zhì)量[4]。本研究擬通過收集中藥治療COPD醫(yī)案處方，應用數(shù)據(jù)挖掘?qū)ζ溆盟幰?guī)律進行總結(jié)，再采用網(wǎng)絡藥理學篩選高頻藥對的關(guān)鍵靶點，探索其發(fā)揮藥效的可能機制，為COPD的臨床辨治和實驗探索提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 分別以“慢性阻塞性肺疾病、COPD、肺脹、喘證、中醫(yī)、醫(yī)家、經(jīng)驗”等關(guān)鍵詞或者主題詞，檢索中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫(WanFang Data)、維普網(wǎng)(VIP)、中國生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫(CBM)，文獻發(fā)表時間1988年1月至2019年12月，搜索應用中醫(yī)藥復方治療COPD的臨床文獻。排除綜述、重復文獻、干預措施不符合文獻，共收集165篇，有效處方439首。

1.2 文獻納入標準 ①中藥治療COPD的臨床病案；②明確提及患者為COPD，無其他兼癥；③方藥組成完備；④臨床療效確切；⑤僅采用中藥湯劑內(nèi)服治療。

1.3 文獻排除標準 ①COPD患者出現(xiàn)合并癥；②重復出現(xiàn)的方劑；③結(jié)合針灸、外敷等中醫(yī)治療方法，或中西醫(yī)結(jié)合治療，無法判斷是否為中藥產(chǎn)生療效的臨床研究。

1.4 數(shù)據(jù)規(guī)范 以2015年版《中國藥典》[5]為標準，同時參考《中藥學》[6]將別名統(tǒng)一，合并同類藥物，如山茱萸、山萸肉統(tǒng)一為山茱萸，生熟地分別為生地黃、熟地黃，仙靈脾、淫羊藿統(tǒng)一為淫羊藿，法半夏、清半夏統(tǒng)一為半夏。

1.5 統(tǒng)計學方法 ①藥物頻次統(tǒng)計分析，應用Excel 2010進行；②關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，采用SPSS Modeler 18.0中Apriori算法進行，支持度為包含某種中藥組合的方劑數(shù)量與全部方劑數(shù)量的百分比，含有A的方劑中含有B的頻率稱中藥A→中藥B的置信度；③復雜網(wǎng)絡分析，采用SPSS Modeler 18.0 Web進行，根據(jù)藥物之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系繪制用藥整體與核心處方的Web網(wǎng)絡圖；④聚類分析，應用SPSS Statistic22.0的分析模塊進行，歸納常用藥物組合，繪制聚類樹狀圖；④因子分析，應用SPSS Statistics 22.0建立原始指標的相關(guān)系數(shù)矩陣，在降維視角下尋找少數(shù)的中藥數(shù)據(jù)來反映所有方藥特征，應用KMO與Bartlett等方法對因子進行適應型檢驗。

1.6 網(wǎng)絡藥理學分析 通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP)，篩選高頻藥對的有效成分及相應靶點，并與Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出COPD的靶點相映射并取交集，作為其治療COPD的潛在靶點。將上述靶點導入STRING11.0數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，根據(jù)degree值篩選出關(guān)鍵靶點，應用R語言進行KEGG通路富集分析，依據(jù)count值篩選重要通路。

2 結(jié)果

2.1 頻次分析 本研究共納入有效處方439首，涉及中藥332味，總頻次6 693次，歸18類，補虛藥、化痰止咳平喘藥、解表藥、清熱藥及利水滲濕藥用藥頻次位居前5，見表1；332味中藥中用藥頻次≥50次共計39味，見表2。

表1 藥物類別分布

表2 高頻藥物頻次分布(頻次>50次)

2.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 運用SPSS Modeler18.0中的Apriori模塊對高頻藥物進行關(guān)聯(lián)，二項關(guān)聯(lián)規(guī)則設置支持度10%，置信度65%；三項關(guān)聯(lián)設置支持度10%，置信度75%，支持度最高的二項和三項關(guān)聯(lián)組合見表3～4。由此可知，二項關(guān)聯(lián)多是健脾化濕、補益脾肺、化痰止咳及溫肺化飲的組合，三項關(guān)聯(lián)多為健脾化濕、降氣化痰及益氣健脾的組合。

表3 二項關(guān)聯(lián)規(guī)則分布(按支持度排序)

2.3 復雜網(wǎng)絡分析 采用SPSS modeler 18.0 Web復雜網(wǎng)絡繪制COPD的用藥整體網(wǎng)絡圖、核心處方網(wǎng)絡圖，通過粗線、細線和虛線表示藥物之間鏈接的強弱程度，見圖1～2，可知核心處方主要由二陳湯和三拗湯加減化裁組成。

圖1 用藥整體網(wǎng)絡圖

圖2 核心處方網(wǎng)絡圖

表4 三項關(guān)聯(lián)規(guī)則分布(按支持度排序)

2.3 常用中藥聚類組合 采用SPSS Statistics 22.0系統(tǒng)聚類對頻次≥50次中藥進行分析，度量區(qū)間采用平方Euclidean距離，通過Ward方法構(gòu)建樹狀聚類，見圖3；共得到12組藥物聚類組合，見表5。

圖3 藥物聚類分析圖

表5 常用藥物系統(tǒng)聚類組合

2.4 常用中藥因子分析 采用SPSS Statistics 22.0對頻數(shù)≥50次中藥進行因子分析，結(jié)果顯示Bartett球形檢驗P=0(<0.001)，KMO=0.614，χ2=3 671.513，df=780，表明適合進行因子分析。采用主成分分析法，進行方差最大化旋轉(zhuǎn)，特征根大于1時，用藥累計貢獻率為58.002%，提取載荷系數(shù)大于0.3的中藥變量組成公因子，共提取出15個公因子，見表6。橫軸為因子序號，縱軸表示特征值大小，生成碎石圖(圖4)，根據(jù)點間聯(lián)線坡度的陡緩程度可比較因子的重要性。根據(jù)“旋轉(zhuǎn)元件矩陣”生成旋轉(zhuǎn)空間原件(圖5)，能直觀看出各變量之間的聚集關(guān)系?；陉P(guān)聯(lián)和聚類及因子分析可知，半夏與陳皮關(guān)系最為密切。

表6 高頻藥物因子分析

圖4 因子分析碎石圖

圖5 旋轉(zhuǎn)空間原件圖

2.5 基于網(wǎng)絡藥理學分析高頻藥對半夏、陳皮治療COPD的機制

2.5.1 藥物活性成分及作用靶點的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP)檢索半夏與陳皮化學成分，以口服生物利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18作為條件，共篩選出候選化合物半夏13個，陳皮5個，作用靶點118個。

2.5.2 COPD相關(guān)靶點的篩選 GeenCards數(shù)據(jù)庫按照relevance score高低篩選前300位相關(guān)靶點，OMIM數(shù)據(jù)庫得到與COPD相關(guān)靶點533個，篩重后獲得疾病相關(guān)靶點520個；與TCMSP數(shù)據(jù)庫預測的靶點相映射，共得到半夏和陳皮治療COPD靶點21個。

2.5.3 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡的構(gòu)建 將共同靶點上傳至String在線平臺數(shù)據(jù)庫，設置物種為人，置信度大于0.4，得到PPI網(wǎng)絡(圖6)，關(guān)鍵靶點蛋白21個，71條邊代表了蛋白之間的相互作用，據(jù)degree值篩選列舉出“陳皮-半夏”治療COPD排名前10的關(guān)鍵靶點(圖7)。

圖6 半夏-陳皮治療COPD靶點的 PPI 網(wǎng)絡

圖7 半夏-陳皮治療COPD的關(guān)鍵靶點

2.5.4 KEGG通路分析 將上述共同靶點應用R語言軟件計算KEGG通路，觀察靶點在通路中的分布情況和藥理作用機制中可能性較大的通路，并進一步篩選與COPD相關(guān)的信號通路，按照Count值篩選出排名前20的通路富集，涉及到到PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路、凋亡通路、TNF信號通路及Relaxin信號通路等。見表7。

表7 KEGG通路富集

3 討論

3.1 痰為COPD關(guān)鍵病因，化痰止咳平喘為基本治法 化痰止咳平喘藥使用頻次位居第二，前二十位高頻藥物中有半夏、苦杏仁、紫菀、款冬花、葶藶子、桔梗、桑白皮7味化痰止咳平喘藥。二項關(guān)聯(lián)及因子分析中陳皮-半夏和三項關(guān)聯(lián)的陳皮-茯苓-半夏組合，體現(xiàn)了化痰在中醫(yī)藥治療COPD中的關(guān)鍵作用。聚類分析中C3前胡、桔梗和C8紫苑、款冬花及F4紫菀、款冬花、百部均能降氣化痰、止咳平喘，且紫菀祛痰尤佳，款冬花止咳更甚[7]。痰飲同源，C5和F2中細辛、干姜，為常用的溫肺化飲、止咳平喘組合。

3.2 COPD發(fā)作源于表邪誘導，治療不忘解表驅(qū)邪 解表藥使用頻次高居第三，高頻藥物中紫蘇、麻黃、桂枝及細辛等具有解表之功。麻黃與細辛及麻黃-紫蘇→苦杏仁的配伍體現(xiàn)COPD治療需解表驅(qū)邪，防止疾病深入。核心處方及聚類組合有麻黃、苦杏仁和甘草，為三拗湯組方，麻黃中麻黃堿能松弛支氣管平滑肌，杏仁中苦杏仁苷能促使呼吸運動趨于安靜而鎮(zhèn)咳平喘，甘草具有鎮(zhèn)咳祛痰解毒等作用[8]，三藥合用，可治療外感風寒誘發(fā)的咳喘。

3.3 COPD易于化熱夾瘀，理當清熱化瘀 聚類分析C9黃芩和丹參，以及因子分析F6魚腥草、黃芩和丹參在治療COPD中經(jīng)常使用。研究顯示魚腥草富含揮發(fā)油、黃酮類、有機酸、生物堿及維生素等化合物，具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒、增強機體免疫功能、抗過敏及鎮(zhèn)咳等作用[9]；黃芩主要成分黃芩苷能抑制NF-κB、TNF-α、IL-β及IL-6的表達，減少炎性細胞浸潤，可清除自由基及超氧陰離子等氧自由基，具有抗氧化作用[10]；丹參中脂溶性成分(如丹參酮ⅡA、隱丹參酮)及水溶性成分(如丹酚酸A、丹酚酸B)均具有降低血液黏稠度、降壓、擴張血管、清除氧自由基等作用[11-12]，三藥合用，清肺化痰、涼血散瘀，是治療痰瘀熱結(jié)證COPD的常用藥物組合。

3.4 培土生金，調(diào)理脾胃，以益肺絕痰 二項關(guān)聯(lián)支持度前三位藥對分別是半夏-陳皮、茯苓-白術(shù)和甘草-白術(shù)；置信度前四位分別是茯苓-白術(shù)、甘草-白術(shù)、甘草-黨參和黃芪-黨參。聚類分析C10，以及因子分析F3中黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)及甘草等藥物。黨參、黃芪、白術(shù)等健脾益氣，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療COPD從脾論治的理念。甘涼滋胃潤肺亦是培土生金法的具體表現(xiàn)，因子分析F9麥冬與南沙參組合，取自沙參麥冬湯，養(yǎng)胃清肺潤燥而不戀邪傷。

3.5 金水相生，調(diào)補肺腎，以納氣平喘 二項關(guān)聯(lián)中五味子-熟地黃及黃芪-補骨脂兩對藥表明，COPD治療過程中肺腎兩虛亦為常見證候，五味子斂肺滋腎，常用于肺虛咳喘；熟地黃、黃芪均味甘、性微溫，熟地黃補腎填精，黃芪補肺氣固衛(wèi)表，兩者合補腎健脾功效之補骨脂，對肺腎兩虛咳喘有良效。系統(tǒng)聚類中的C1與因子分析中的F1藥物組成相同，山茱萸、山藥和熟地黃作為六味地黃丸三補組合，在臨床治療肺脾腎三臟俱虛的虛損性咳喘中經(jīng)常使用。

3.6 高頻藥對“半夏-陳皮”治療COPD機制呈多靶點和多通路特性 通過分析高頻藥對“半夏-陳皮”治療COPD的潛在機制呈現(xiàn)多靶點和多通路特點，主要靶點為CAT、JUN、NOS2、CYCS、MPO、VEGFA、MMP-9、SOD及HIF-1α等，它們參與氧化還原、細胞老化、轉(zhuǎn)錄因子激活、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、胞質(zhì)靶蛋白結(jié)合、電子載體蛋白結(jié)合、內(nèi)皮細胞增殖及抑制細胞凋亡等生物學過程。R語言KEGG富集分析，篩選出PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)及TNF信號通路(TNF signaling pathway)等為重要通路。研究證實上述關(guān)鍵靶點和重要通路在COPD的發(fā)病過程中有致病作用[13-16]，表明“半夏-陳皮”藥對治療COPD有潛在研究價值。

4 結(jié)論

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)總結(jié)439例中醫(yī)藥治療COPD處方的用藥規(guī)律，揭示中醫(yī)藥治療COPD多從痰、熱、虛、瘀等多方面認識，發(fā)作緣于外邪誘發(fā)，易于化熱夾瘀，治療多以清熱化痰祛瘀為法，并透散表邪；本虛以肺脾腎三臟虧虛為主，重視培土生金和金水相生治療原則，為臨床治療COPD提供參考，但具體機制還需進一步臨床和實驗驗證。