β-細辛醚聯(lián)合左旋多巴對帕金森病大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

黃麗平， 周中流， 寧百樂， 張芹欣， 鄧敏貞*

(1.嶺南師范學院，廣東 湛江 524048；2.廣東省中醫(yī)院，廣東省中醫(yī)藥科學院，廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510120)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、姿勢不穩(wěn)，其主要病理特點為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元嚴重缺失和紋狀體多巴胺(DA)神經(jīng)遞質(zhì)的急劇下降[1]，發(fā)病前期可用左旋多巴(L-dopa)治療，但在2～5年后療效逐漸不明顯，并且后期會出現(xiàn)癥狀波動與異動癥，是相關(guān)治療的最大難題[2]。研究表明，石菖蒲揮發(fā)油有效成分β-細辛醚具有一定的神經(jīng)藥理作用[3]，課題組前期發(fā)現(xiàn)該成分聯(lián)合L-dopa后可改善帕金森病大鼠行為障礙[4]，還能調(diào)節(jié)血腦屏障相關(guān)蛋白表達[5]，但聯(lián)合用藥作用機制尚不明確。因此，本實驗著重探討β-細辛醚聯(lián)合L-dopa用藥對帕金森病大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 石菖蒲購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部唐洪梅主任鑒定為正品。左旋多巴片(批號19130501，上海福達制藥有限公司)；美多巴(批號SH1609，上海羅氏制藥有限公司)；6-羥基多巴(6-OHDA)(批號H116)、阿撲嗎啡(APO)(批號100839-20060)(美國Sigma公司)。酪氨酸羥化酶(TH)、兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)ELISA試劑盒(批號12/2018)(上海繼錦化學科技有限公司)；DDC抗體(貨號ab3905)、GAPDH抗體(貨號ab8245)(英國Abcam公司)；羊抗兔抗體(貨號CW0114)、羊抗鼠抗體(貨號CW0113)(北京康為世紀生物科技有限公司)；ECL試劑盒(美國Bio-Rad公司)。

1.2 儀器 Multiskan MK3 酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)； AE-200型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Waters-200型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；ZB-200 疲勞轉(zhuǎn)棒儀(成都泰盟科技有限公司)；腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；ARATHON牙科鉆(韓國Saeyang公司)；電泳裝置和轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.3 動物 無特定病原體級SD大鼠，100只，雌雄各半，體質(zhì)量220～250 g，購自廣州中醫(yī)藥大學，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2008-0020，適應環(huán)境3 d后進行實驗。

1.4 β-細辛醚制備 按照2015年版《中國藥典》一部附錄揮發(fā)油提取方法提取石菖蒲揮發(fā)油，得率大于1%，采用冷凍結(jié)晶法將其進行純分，得到白色晶體，即為β-細辛醚，通過GC-MS檢測證實其純度在99%以上[6]。

1.5 造模 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，將其頭部固定于腦立體定位儀上，定位于大鼠左腦的前腦內(nèi)側(cè)束(MFB)(AP-4.4 mm，ML-1.2 mm，DV-7.8 mm)，注射6 μL 6-OHDA(4 mg/mL)，注射速度為0.5 μL/min，注射完畢留針15 min，緩慢取出微量注射器，假手術(shù)組同法注射含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。造模1個月后，大鼠腹腔注射0.5 mg/kg阿撲嗎啡，以向健側(cè)旋轉(zhuǎn)數(shù)大于7圈/min為造模成功。

1.6 分組 將70只造模大鼠隨機分為7組，每組10只，雌雄各半，分別為模型組，美多巴組(75 mg/kg)，L-dopa組(60 mg/kg)，β-細辛醚組(15 mg/kg)，聯(lián)合低、中、高劑量組[L-dopa 60 mg/kg+ β-細辛醚(7.5、15、30 mg/kg)]，灌胃給藥，正常組、模型組大鼠按0.5 mL/kg劑量灌胃給予蒸餾水，每天2次，持續(xù)30 d。

1.7 指標檢測

1.7.1 大鼠腦組織和血漿中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平 各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后打開腹腔，分離腹主動脈，一次性注射器取動脈血，置于相應編號含肝素鈉的采血管中，3 500 r/min離心20 min，取上清液(血漿)置于相應編號的離心管中，在-20 ℃下保存。打開大鼠胸腔，0.9%生理鹽水灌注心臟至肺完全變白為止，開顱取腦，分離造模側(cè)的紋狀體，置于相應編號的離心管中，在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取血漿500 μL至相應編號的離心管中，按1∶1比例加入500 μL 5%高氯酸，渦旋混勻，離心(14 000 r/min，4 ℃)10 min，上清液過濾后置于相應編號的樣品瓶中，在4 ℃下待測。將造模側(cè)的紋狀體按1∶5比例加入5%高氯酸，電動勻漿，離心(14 000 r/min，4 ℃)10 min，上清液過濾后置于相應編號的樣品瓶中，在4 ℃下待測。分析條件為ODS2色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.1 mol/L KH2PO4-甲醇(80∶20)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃，檢測L-dopa、多巴胺(DA)、高香草酸(HVA)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、5-羥色胺(5-HT)水平。

1.7.2 ELISA檢測紋狀體和血漿中酪氨酸羥化酶(TH)、兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)活性 將大鼠紋狀體按1∶5比例加入0.9%生理鹽水，電動勻漿，離心(14 000 r/min，4 ℃)，上清液過濾后置于相應編號的樣品瓶中，在4 ℃下待測。嚴格按照ELISA說明書操作步驟，檢測大鼠紋狀體和血漿中TH、COMT水平。

1.7.3 Western blot法檢測DDC表達 大鼠紋狀體組織冷凍勻漿后，4 ℃、14 000 r/min離心一段時間，上清液經(jīng)BCA法定量，上樣量為50 μg，電泳條件為110 V、60 min，濕法轉(zhuǎn)膜，條件為200 mA、60 min，DDC一抗?jié)舛?∶1 000，二抗?jié)舛?∶2 000，其他操作步驟同常規(guī)Western blot法，采用ECL試劑盒在化學發(fā)光檢測器中檢測，采用Image-pro軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平 與假手術(shù)組比較，模型組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，美多巴組、聯(lián)合各劑量組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平升高(P<0.05，P<0.01)，L-dopa組、β-細辛醚組DA、DOPAC、HVA、5-HT水平亦然(P<0.05)；與L-dopa組比較，美多巴組、聯(lián)合高劑量組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平升高(P<0.05，P<0.01)，β-細辛醚組DA、DOPAC、HVA水平降低(P<0.05)，聯(lián)合低、中劑量組L-dopa水平升高(P<0.01)；與美多巴組比較，β-細辛醚組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平降低(P<0.05，P<0.01)；聯(lián)合低劑量組L-dopa、DA、DOPAC、HVA及聯(lián)合中劑量組L-dopa、DOPAC、HVA水平降低(P<0.05，P<0.01)，聯(lián)合高劑量組L-dopa水平亦然(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平

2.2 大鼠血漿中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平 與假手術(shù)組比較，模型組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，美多巴組、L-dopa組、β-細辛醚組、聯(lián)合各劑量組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平升高(P<0.05，P<0.01)；與L-dopa組比較，美多巴組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平升高(P<0.05，P<0.01)，β-細辛醚組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平降低(P<0.05，P<0.01)。聯(lián)合各劑量組L-dopa、DOPAC、HVA水平降低(P<0.05，P<0.01)，而DA、5-HT水平升高(P<0.05)；與美多巴組比較，β-細辛醚組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平降低(P<0.05，P<0.01)，聯(lián)合各劑量組L-dopa、DOPAC、HVA水平亦然(P<0.05，P<0.01)，而DA水平升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血漿中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平

2.3 大鼠紋狀體和血漿中相關(guān)酶活性

2.3.1 紋狀體 與假手術(shù)組比較，模型組COMT、TH活性降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組COMT、TH活性升高(P<0.05，P<0.01)；與L-dopa組比較，美多巴組和聯(lián)合中、高劑量組COMT、TH活性升高(P<0.05)，β-細辛醚組TH活性亦然(P<0.01)；與美多巴組比較，β-細辛醚組、聯(lián)合低劑量組COMT、TH活性降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠紋狀體和血漿中相關(guān)酶活性

2.3.2 血漿 與假手術(shù)組比較，模型組COMT、TH活性降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組COMT、TH活性均升高(P<0.05，P<0.01)；與L-dopa組比較，美多巴組、聯(lián)合中高劑量組COMT、TH活性升高(P<0.05)，而β-細辛醚組COMT活性降低(P<0.05)；與美多巴組比較，β-細辛醚組、聯(lián)合低劑量組TH活性降低(P<0.05)，見表3。

2.4 大鼠紋狀體中DDC表達 與假手術(shù)組比較，模型組DDC表達降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組DDC表達升高(P<0.05)；與美多巴組、L-dopa組比較，β-細辛醚組、聯(lián)合用藥各劑量組DDC表達升高(P<0.05)，見圖1。

注：A為假手術(shù)組，B為模型組，C為美多巴組，D為左旋多巴組，E為β-細辛醚組，F(xiàn)為聯(lián)合低劑量組，G為聯(lián)合中劑量組，H為聯(lián)合高劑量組。與假手術(shù)組比較，@@P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與L-dopa組比較，#P<0.05，##P<0.01；與美多巴組比較，&P<0.05，&&P<0.01。

3 討論

多巴胺替代療法可改善帕金森病癥狀但不能阻止這種神經(jīng)退化的進程[7]。目前，DA的前體藥物L-dopa是DA替代療法的典型代表藥物，是帕金森病治療最有效的藥物，可以改善PD患者的生活質(zhì)量[8]。但長期單一應用L-dopa在帕金森治療中會產(chǎn)生嚴重不良反應[9]。美多巴(L-dopa+芐絲肼)被稱為“黃金標準”在帕金森病治療，可提高腦中L-dopa水平，從而提高DA水平[10]。然而，美多巴也會產(chǎn)生運動障礙等副作用[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)β-細辛醚容易透過血腦屏障和廣泛分布在大腦[12]。它具有中樞神經(jīng)藥理作用[13]。它還可以減弱自噬的調(diào)節(jié)物p-JNK、Bcl-2和Beclin-1，減少6-OHDA所致的腦損傷[14]。這提示β-細辛醚可能有助于PD減輕多巴胺能神經(jīng)元損傷。

美多巴依賴于L-dopa來維持紋狀體DA水平從而治療帕金森[15]。關(guān)鍵是芐絲肼可以抑制L-dopa在外周血脫羧和促進L-dopa部分傳遞到BBB的過程[16]。本研究結(jié)果表明，聯(lián)合各劑量組紋狀體的L-dopa水平遠低于美多巴組，但聯(lián)合高劑量組紋狀體DA水平與美多巴組相當。L-dopa轉(zhuǎn)化為DA只有通過DDC酶的脫羧作用[17]。此外，β-細辛醚組和聯(lián)合各劑量組紋狀體中DDC的表達高于其他治療組。因此，推斷β-細辛醚可能增強DDC的活性。TH是兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)如DA生物合成過程所需的限速酶，也是多巴胺能神經(jīng)元的標志酶，催化酪氨酸的羥化而生成多巴，而COMT是促進DA代謝的主要相關(guān)酶之一。而紋狀體中美多巴組和聯(lián)合中和高劑量組TH和COMT水平相近，這一結(jié)果表明美多巴組和聯(lián)合中和高劑量組對DA代謝程度影響相近。以上結(jié)果提示，聯(lián)合用藥可能是通過增強DDC活性來提高紋狀體DA水平，其相關(guān)機制可能與美多巴治療帕金森病的機制不同。此外，美多巴組和聯(lián)合高劑量組紋狀體中DOPAC和HVA含量相似，即美多巴組與聯(lián)合高劑量組對多巴胺代謝影響區(qū)別不大。

在血漿中，美多巴組L-dopa最高，L-dopa的含量高于聯(lián)合各劑量組，而DA水平剛好與之相反。重要的是，聯(lián)合各劑量組DDC表達均高于其他治療組，呈一定的劑量依賴性。結(jié)果表明β-細辛醚可加速L-dopa脫羧過程。此外，聯(lián)合各劑量組和美多巴組COMT水平相近。聯(lián)合各劑量組DOPAC和HVA水平高于模型組。聯(lián)合高劑量組HVA與美多巴組相近。結(jié)果表明聯(lián)合用藥同時促進DA的代謝和提高COMT的活性。

除此之外，研究發(fā)現(xiàn)5-HT激活的障礙已經(jīng)涉及帕金森病的精神障礙[18]。6-OHDA損傷的帕金森病大鼠可能誘發(fā)類似焦慮行為[19]。有研究發(fā)現(xiàn)帕金森病大鼠紋狀體DA和5-HT沒有明顯的相關(guān)性[20]。結(jié)果表明聯(lián)合各劑量組和美多巴組5-HT在血漿和紋狀體顯示無統(tǒng)計學意義。因此，聯(lián)合用藥治療帕金森病大鼠對紋狀體的5-HT影響不明顯。

綜上所述，β-細辛醚和L-dopa聯(lián)合用藥可提高紋狀體DA水平，可能是通過調(diào)節(jié)DA相關(guān)酶(DDC、COMT和TH)作用從而促進L-dopa轉(zhuǎn)化，大大提高L-dopa在大腦內(nèi)的使用程度，避免其在外周的代謝，將大大減少L-dopa的使用劑量和副作用。因此，β-細辛醚和L-dopa聯(lián)合應用可能是一種潛在治療帕金森的有效方案。