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    基于分子對接虛擬篩選PBP2a蛋白蒲公英活性成分抗菌劑

    2021-10-26 01:27:18呂小剛梁引庫穆阿寧
    關(guān)鍵詞:齊墩果酸殘基

    劉 旭, 呂小剛, 梁引庫,2*, 穆阿寧

    (1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 漢中 723000; 2.陜西省資源生物重點實驗室, 陜西 漢中 723000)

    青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)在細菌細胞壁的形成過程中起著關(guān)鍵作用。β-內(nèi)酰胺類抗生素可以結(jié)合PBPs,從而影響細胞壁肽聚糖的生物合成,起到殺菌作用。其作用機制為抗生素與PBPs可形成共價?;笍?fù)合物,它抑制了細胞壁轉(zhuǎn)肽而使脫?;磻?yīng)受阻來殺死細菌[1]。但耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)作為典型的耐藥菌,其產(chǎn)生的PBP2a作為一種較為特殊的青霉素結(jié)合蛋白,與抗生素親和力很低從而導(dǎo)致廣譜耐藥一直威脅著人類的安全[2]。作為治療MRSA感染的有效藥物萬古霉素及相對新型藥物利奈唑胺和達托霉素已經(jīng)不足以滿足當前需求,開發(fā)一種新型抗耐藥類藥物迫在眉睫。而中藥具有廣譜抗菌作用,表現(xiàn)出多組分多途徑的作用功效,是現(xiàn)今逐漸被認可的有效抗菌藥物。從中藥中尋找一種或幾種天然活性物質(zhì)直接作用于細菌表面或協(xié)同抗生素增加MRSA對藥物敏感性為近年來的研究熱點。由于傳統(tǒng)實驗篩選新藥周期長,為減少藥物篩選的盲目性,提高研發(fā)效率,采用分子對接技術(shù)虛擬篩選得到與靶蛋白緊密結(jié)合的候選化合物,從而提高新藥研究的成功率。谷宇等[3]利用分子對接技術(shù)靶向篩選大黃、羌活和秦艽幾味中藥抗炎活性成分,得到了12個天然抗炎活性抑制劑;周月等[4]同樣利用分子對接技術(shù)篩選出了23個打分高于陽性藥物的菊苣活性成分。作為篩選中藥藥效物質(zhì)的一種手段,分子對接在一定程度上可以闡明蛋白與小分子配體的相互作用機制。

    蒲公英具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[5-10],是一種常用的清熱解毒、抗菌消炎中藥。本研究采用分子對接技術(shù)將蒲公英活性成分與MRSA耐藥相關(guān)的PBP2a蛋白進行虛擬篩選,以期得到能有效結(jié)合PBP2a的蒲公英活性物質(zhì),同時闡明PBP2a蛋白與小分子的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

    PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/),PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。

    軟件:Auto Dock Tools 1.5.6,Auto Dock Vina[11],PyMol,Discovery Studio2019(DS),Chem Draw 2017,Chem 3D。

    1.2 分子對接模擬

    (1)PBP2a蛋白結(jié)構(gòu)準備:由于PBP2a蛋白已被解析,我們從蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB中下載PBP2a蛋白的晶體結(jié)構(gòu)作為初始結(jié)構(gòu),蛋白編號為5M19[12],基源為金黃色葡萄球菌,并用DS軟件進行預(yù)處理,該蛋白為兩條相同的鏈,去除其中一條鏈,包括去除水分子,添加極性氫原子,計算點電荷,添加原子類型等[13],處理后的蛋白結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示。

    (2)結(jié)合口袋確認:由于該蛋白為PBP2a與苯唑西林的復(fù)合物,苯唑西林與PBP2a催化區(qū)域附近的氨基酸形成氫鍵,利用DS軟件以原配體作為參考來確認結(jié)合位點。提取原配體苯唑西林,與處理過的蛋白進行對接,將此時配體位點坐標設(shè)置為活性中心(如圖1(b)所示),參數(shù)為x=-20.644 529,y=-17.791 824,z=51.806 000,size=35,其余均為默認值。原配體苯唑西林對接后構(gòu)象與未對接原配體結(jié)構(gòu)相比,RMSD值≤0.2 nm,說明此對接方法較為準確,具有可行性且對接參數(shù)設(shè)置合理[14]。

    (a)預(yù)處理結(jié)構(gòu)圖 (b)PBP2a蛋白結(jié)合口袋 圖1 PBP2a蛋白及與苯唑西林結(jié)合結(jié)構(gòu)圖

    (3)蒲公英活性成分結(jié)構(gòu)準備:蒲公英活性成分初始結(jié)構(gòu)用Chem Draw畫出小分子結(jié)構(gòu),并分別用Chem Draw進行能量最小化并存儲轉(zhuǎn)化為mol2格式,再利用Autodock tools將小分子轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。

    (4)分子對接:分子對接采用半柔性對接法,對PBP2a蛋白進行剛性處理,固定其構(gòu)象,確定活性分子的可旋轉(zhuǎn)鍵使其可進行自由轉(zhuǎn)動。將處理好的蛋白與小分子化合物使用Vina軟件進行對接,將蒲公英中小分子化合物能量低于原配體苯唑西林的作為候選化合物,并采用結(jié)合自由能最低的構(gòu)象作為最佳結(jié)果,其中靶點親和力排名前10%的認定為陽性結(jié)果,最后利用DS軟件得到對接結(jié)果及圖像并做最后的分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PBP2a蛋白與蒲公英小分子結(jié)合分析

    使用Autodock vina軟件獲得63個蒲公英活性分子與PBP2a相互作用的結(jié)合能,以及對接氨基酸殘基,具體見表1。其中包括原配體苯唑西林,原配體氫鍵作用的氨基酸殘基為THR165,可以看出在對接的63個復(fù)合物構(gòu)象中,前57個結(jié)合能量均低于原配體苯唑西林,結(jié)合最為穩(wěn)定的蒲公英活性物質(zhì)為蒲公英甾醇、異綠原酸A、款冬二醇、羽扇豆醇、齊墩果酸。這表明蒲公英甾醇、異綠原酸A、款冬二醇、羽扇豆醇以及齊墩果酸可能為PBP2a蛋白的配體物質(zhì)。依據(jù)結(jié)合能量最低原理篩選出前5個作為對接最佳活性分子進行下一步研究。

    表1 PBP2a蛋白與蒲公英活性物質(zhì)分子對接結(jié)果

    續(xù)表

    注:“—”表示與PBP2a無氫鍵相互作用。

    2.2 蒲公英甾醇與PBP2a蛋白的分子對接結(jié)果分析

    用DS軟件分析蒲公英甾醇與PBP2a蛋白的對接結(jié)果,二者主要形成疏水間作用力。其結(jié)合自由能為-9.9 kcal/mol。蒲公英甾醇與PBP2a蛋白作用的氨基酸殘基為TYR373、PRO258、VAL277、ARG151、ARG241(圖2)。

    (a)3D圖

    (b)2D圖圖2 蒲公英甾醇與PBP2a蛋白相互作用圖

    2.3 異綠原酸A與PBP2a蛋白的分子對接結(jié)果分析

    用DS軟件分析蒲公英異綠原酸A與PBP2a蛋白的對接,結(jié)果發(fā)現(xiàn)異綠原酸A與PBP2a蛋白作用的氨基酸殘基為THR165、ARG151、ASP295、GLN292、GLU294、ARG241、TYR272,主要通過氫鍵和疏水鍵相互作用,其中異綠原酸A與THR165、ARG151、ASP295、GLN292、GLU294形成氫鍵外,還能與TYR272形成π-π堆積作用(圖3),其總的結(jié)合能量為-9.7 kcal/mol。另外原配體苯唑西林與THR165也存在著氫鍵相互作用,這意味著THR165作為一個關(guān)鍵氨基酸殘基與PBP2a蛋白結(jié)合。

    (a)3D圖

    (b)2D圖圖3 異綠原酸A與PBP2a蛋白相互作用圖

    2.4 款冬二醇與PBP2a蛋白的分子對接結(jié)果分析

    同上,款冬二醇與PBP2a蛋白作用的氨基酸殘基為MET372、PRO258、VAL277、VAL256、ARG151、ARG241,其中款冬二醇與PBP2a蛋白以氫鍵形式作用,形成氫鍵的氨基酸殘基為MET372,其余均為疏水間相互作用力(圖4)。其結(jié)合總能量為-9.7 kcal/mol。

    (a)3D圖

    (b)2D圖圖4 款冬二醇與PBP2a蛋白相互作用圖

    2.5 羽扇豆醇與PBP2a蛋白的分子對接結(jié)果分析

    羽扇豆醇與PBP2a蛋白作用的氨基酸殘基為ARG151、VAL256、ARG241、VAL277、PRO258,雖然根據(jù)能量最低原則視其結(jié)合構(gòu)象較為穩(wěn)定,能量為-9.6 kcal/mol,但其作用力均為疏水間相互作用力,而沒有以作用力更強的氫鍵作用(圖5)。

    2.6 齊墩果酸與PBP2a蛋白的分子對接結(jié)果分析

    用DS軟件分析齊墩果酸與PBP2a蛋白的對接,結(jié)果發(fā)現(xiàn)齊墩果酸與PBP2a蛋白作用的氨基酸殘基為THR216、PRO258、VAL277、VAL256、ARG151、ARG241,主要通過氫鍵和疏水鍵相互作用,齊墩果酸與THR216通過氫鍵相互作用,PRO258、VAL277、VAL256、ARG151、ARG241殘基與齊墩果酸形成疏水作用。其結(jié)合總能量為-9.3 kcal/mol(圖6)。

    (a)3D圖

    (b)2D圖圖5 羽扇豆醇與PBP2a蛋白相互作用圖

    3 結(jié)果與討論

    青霉素結(jié)合蛋白PBP2a對細胞膜具有修復(fù)作用,其活性可降低一些破壞膜類抗生素的抑菌效果。主要原因是PBP2a蛋白活性位點SER位于狹窄的延伸處,不易與β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合[15],進而起到抗菌作用。因此發(fā)現(xiàn)一種能有效與PBP2a蛋白結(jié)合,降低PBP2a蛋白膜修復(fù)活性,就能有效協(xié)同β-內(nèi)酰胺類抗生素發(fā)揮抗菌作用,達到治療的目的。

    (a)3D圖

    (b)2D圖圖6 齊墩果酸與PBP2a蛋白相互作用圖

    分子對接虛擬篩選結(jié)果表明,多數(shù)蒲公英活性物質(zhì)與PBP2a是通過氫鍵和范德華力作用。根據(jù)結(jié)合穩(wěn)定性原理,本文分別研究了57個蒲公英活性成分與PBP2a結(jié)合及結(jié)合穩(wěn)定性,根據(jù)結(jié)合能量篩選出5個能與PBP2a穩(wěn)定結(jié)合的蒲公英小分子,即蒲公英甾醇、異綠原酸A、款冬二醇、羽扇豆醇和齊墩果酸。進一步分析發(fā)現(xiàn)蒲公英甾醇、異綠原酸A、款冬二醇、羽扇豆醇、齊墩果酸這5種物質(zhì)都與ARG151、ARG241氨基酸殘基形成氫鍵作用。說明ARG可能為潛在的關(guān)鍵氨基酸殘基。其中異綠原酸A可以通過破壞細菌細胞壁、增加細胞膜通透性來抑制細菌生長[16],齊墩果酸也被報道有一定的抑菌作用。有研究表明PBP2a蛋白活性位點為SER403,而MET641和TYR446為活性位點側(cè)鏈的氨基酸殘基[12],小分子化合物可能無法直接進入活性位點,而可以通過側(cè)鏈影響其變構(gòu)位點發(fā)生變化,從而使其他小分子有機會結(jié)合到活性位點。也有研究表明一些和mecA無關(guān)的基因也能導(dǎo)致細菌產(chǎn)生耐藥,臨床上已發(fā)現(xiàn)一種邊緣性耐苯唑西林金黃色葡萄球菌(borderline oxacillin-resistant S.aureus,BORSA)[17-18],不攜帶mecA和mecC基因,它對苯唑西林有輕微的耐藥性,有研究發(fā)現(xiàn)其分離株和野生株會發(fā)生突變,從而導(dǎo)致其對抗生素的耐藥。因此可基于多組學(xué)技術(shù)或者多組學(xué)聯(lián)用探究抗生素或中藥活性成分與細菌之間的作用機制,有助于從新的角度靶向挖掘新的抗生素佐劑和抗菌劑。

    由于原配體作用的氨基酸殘基為THR165,齊墩果酸氫鍵相互作用的氨基酸殘基為THR,由此可推測THR可能為PBP2a蛋白的關(guān)鍵氨基酸殘基。上述蒲公英活性成分與靶蛋白氨基酸殘基具有較好的氫鍵作用力,可作為MRSA的候選抑制劑。

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