線粒體質(zhì)量控制體系介導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷的治療策略

周曼麗，俞赟豐，馮 宇，羅曉欣，蘭曉棟，金夢(mèng)雨，簡維雄,

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208

2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 國家重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208

急性心肌梗死仍然是世界范圍內(nèi)最常見的死亡原因。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療及時(shí)恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流是目前指南推薦的急性心肌梗死患者的治療方案[1-2]。很大一部分心臟損傷發(fā)生在冠狀動(dòng)脈血流恢復(fù)后的再灌注早期[3]。盡管已知再灌注后會(huì)發(fā)生損傷，但臨床治療總是側(cè)重于立即再通[4]。線粒體功能障礙和由此產(chǎn)生的氧化應(yīng)激是包括心臟缺血性損傷在內(nèi)的幾種疾病發(fā)病機(jī)制的核心[5]。盡管生命科學(xué)工作者們對(duì)缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷的病理機(jī)制已經(jīng)有了多年的研究，但臨床缺乏相應(yīng)的治療手段限制I/R損傷患者的預(yù)后一直未得到解決[4]。線粒體的融合、分裂、生物發(fā)生、自噬及其錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用構(gòu)成了線粒體有效的質(zhì)量控制系統(tǒng)[6-7]。線粒體質(zhì)量控制在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞存活方面起著重要作用[6]。損傷、老化和功能障礙的線粒體的移除是由線粒體自噬介導(dǎo)的，在線粒體動(dòng)力學(xué)適當(dāng)改變的幫助下，通過線粒體的生物發(fā)生產(chǎn)生新的線粒體以滿足細(xì)胞的能量需求[6]。本文主要綜述I/R損傷中線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)的分子機(jī)制以及確立以線粒體為潛在治療靶點(diǎn)的可能性。

1 線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)與I/R損傷

線粒體發(fā)生融合/分裂變化的過程被稱為線粒體動(dòng)力學(xué)[8-9]。線粒體外膜融合蛋白1（mitofusins 1，Mfn1）和Mfn2對(duì)于保護(hù)線粒體功能和胚胎發(fā)育都是必不可少的[10]。Mfn1的表達(dá)減少會(huì)使融合/分裂的平衡轉(zhuǎn)向更多的分裂[11]。Mfn2的激活被證實(shí)可以逆轉(zhuǎn)線粒體的損傷[12-13]。定位于面向線粒體膜間隙的視神經(jīng)萎縮癥蛋白1（optic atrophy1，OPA1）具備S型（可溶性存在于線粒體膜間隙）和L型（錨定于線粒體內(nèi)膜）2種亞型[14]。國內(nèi)外研究一致認(rèn)為，L-OPA1與內(nèi)膜融合有關(guān)，而S-OPA1與應(yīng)激條件下的內(nèi)膜分裂有關(guān)[15]。除了介導(dǎo)相鄰線粒體內(nèi)膜的融合，OPA1還控制內(nèi)膜嵴的完整性[6,16]，并且通過嵴內(nèi)可溶性細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）的區(qū)域化來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[17-18]。

線粒體分裂可以是有益的，也可以是有害的，這取決于具體情況[19]。線粒體的分裂是線粒體生物發(fā)生所必需的，也是通過線粒體自噬來控制其質(zhì)量所必需的[20]。動(dòng)力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）被認(rèn)為是選擇性移除受損線粒體的潛在上游效應(yīng)因子[21]。Drp1敲除會(huì)破壞線粒體分裂，形成延長的線粒體并抑制線粒體自噬，從而在面臨I/R損傷時(shí)導(dǎo)致更嚴(yán)重的心功能障礙[22]。

自噬體的大量積累既是對(duì)I/R應(yīng)激的反應(yīng)，也是一種誘導(dǎo)線粒體自噬的情況[23]。當(dāng)線粒體動(dòng)力學(xué)受損時(shí)，由于彼此之間缺乏相互作用，功能受損的線粒體發(fā)生群體積累[24]。受損的線粒體不能恢復(fù)到健康狀態(tài)時(shí)，線粒體自噬很可能是在細(xì)胞凋亡和壞死之前移除受損的線粒體和維持細(xì)胞活性的最后保障[6]。Mfn1/2不僅調(diào)節(jié)線粒體外膜融合，而且還能阻止受損線粒體與健康線粒體融合，從而作為Parkin促進(jìn)線粒體自噬的底物[25-26]。Mfn2對(duì)心臟線粒體自噬的積極作用已經(jīng)被提出[6]。Mfn2的表達(dá)改善了I/R損傷表型，而Mfn2的下調(diào)則加重了損傷表型[27]。此外，Mfn2在小鼠心肌代謝轉(zhuǎn)變中起著核心作用，胎兒心肌細(xì)胞中的線粒體經(jīng)過磷酸酶及張力蛋白同源物誘導(dǎo)的蛋白激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）-Mfn2-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，在圍產(chǎn)期發(fā)生從碳水化合物到脂肪酸的代謝轉(zhuǎn)變，以便它們被成熟的線粒體替代，而不是轉(zhuǎn)錄重編程[28]。

線粒體通過誘導(dǎo)生物發(fā)生參與能量平衡的調(diào)節(jié)。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）-過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1alpha，PGC-1α）軸和沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（sirtuin 1，Sirt1）-PGC-1α軸是調(diào)控線粒體生物發(fā)生的2條主要途徑[29]。I/R損傷發(fā)生后，AMPK可以直接磷酸化PGC-1α，也可以通過提高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）水平激活Sirt1。PGC-1α被磷酸化后，從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核，觸發(fā)線粒體的生物發(fā)生[29-30]。積極調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量體系的想法不僅是選擇性地剔除個(gè)別受損的線粒體，而是在I/R損傷發(fā)生后能量代謝危機(jī)時(shí)，在整個(gè)細(xì)胞和器官范圍內(nèi)促進(jìn)線粒體周轉(zhuǎn)，緩解細(xì)胞內(nèi)環(huán)境壓力[28]。

線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)的示意圖見圖1。

圖1 線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)的示意圖Fig.1 Schematic diagram of mitochondrial quality control system

2 治療策略

雖然臨床上針對(duì)冠心病形成病理因素的早期藥物治療已經(jīng)層出不窮（臨床上調(diào)脂、降壓、抗血小板聚集等藥物的運(yùn)用），但不得不承認(rèn)的是，當(dāng)心腦血管疾病意外發(fā)生時(shí)，并沒有比較適合的治療手段去應(yīng)對(duì)，尤其是面向21世紀(jì)人民生活日益優(yōu)越的今天。關(guān)于線粒體質(zhì)量控制體系的各個(gè)方面，包括融合和分裂動(dòng)力學(xué)、線粒體的生物發(fā)生、線粒體自噬與線粒體移植，這些都是具有藥物開發(fā)前途的領(lǐng)域[31]。

2.1 藥物治療：抑制過度分裂，促進(jìn)適當(dāng)融合

2.1.1 抑制I/R損傷引起的線粒體過度分裂 過度的線粒體分裂與細(xì)胞死亡增加和心肌I/R損傷相關(guān)[32]。心肌I/R后線粒體分裂顯著增加。缺血誘導(dǎo)的分裂涉及Drp1移位到線粒體與線粒體分裂蛋白1（fission protein 1，F(xiàn)is1）的相互作用，而觀察到的線粒體破碎被廣泛認(rèn)為是Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂增加的證據(jù)[33-34]。抑制線粒體過度分裂被認(rèn)為是保護(hù)I/R損傷后心功能不全的潛在機(jī)制[35]。

mdivi-1是一種Drp1 GTPase抑制劑，可以選擇性地抑制酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Drp1的組裝和GTPase活性來抑制線粒體的碎裂[31]。再灌注前15 min ip Drp1小分子抑制劑mdivi-1（1.2 mg/kg），可顯著抑制糖尿病小鼠Drp1移位到I/R后的線粒體外膜，減少線粒體的分裂，碎片化程度顯著降低，線粒體動(dòng)力學(xué)得到改善，線粒體變得更長、更飽滿。免疫熒光結(jié)果分析顯示線粒體網(wǎng)絡(luò)增多[36]，線粒體向融合方向轉(zhuǎn)變，細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）濃度也增加[37]，末端標(biāo)記法陽性細(xì)胞數(shù)量和半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）活性均降低，線粒體功能和心功能得到顯著改善[32,38]。在小鼠心臟驟停體內(nèi)模型中，mdivi-1可以改善主動(dòng)脈結(jié)扎引起的心力衰竭[39]，減少心肌梗死面積[32]，并提高模型組小鼠的存活率[40]。目前，mdivi-1正在考慮進(jìn)行臨床試驗(yàn)，在細(xì)胞和嚙齒動(dòng)物模型中，獲得關(guān)于mdivi-1的全面的生化、分子、細(xì)胞生物學(xué)和電子顯微鏡數(shù)據(jù)是很重要的[41]。然而，使用大型動(dòng)物（豬）的急性心肌梗死模型，在再灌注開始時(shí)給予mdivi-1治療未能保留左心室功能或縮小心肌梗死范圍。此外，還發(fā)現(xiàn)mdivi-1治療后分裂幾乎沒有變化，Ong等[42]實(shí)驗(yàn)研究也得出了相似的結(jié)果，與模型組相比，冠狀動(dòng)脈內(nèi)單次注射mdivi-1，并不能縮小急性心肌梗死后的心肌梗死面積大小，沒有顯示出任何心臟保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)表明有必要使用更特異的Drp1抑制劑。

P110選擇性地抑制Drp1/Fis1的相互作用。除了競(jìng)爭Fis1與Drp1的相互作用外，它還可以直接與Drp1結(jié)合，并抑制其GTPase活性[43]。在常氧條件下，原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞只有不到10%的線粒體碎裂。缺血和復(fù)氧處理后，（30±5）%的細(xì)胞表現(xiàn)出過度的線粒體碎裂（點(diǎn)狀線粒體），這種作用在P110存在的情況下抑制了（58±4）%，同時(shí)P110處理使末端標(biāo)記法陽性細(xì)胞減少了（38±2）%，活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量降低到基礎(chǔ)水平[44]。在再灌注開始時(shí)，P110對(duì)Drp1/Fis1相互作用的急性抑制減少了線粒體的異常分裂，改善了生物能量學(xué)，保護(hù)新生大鼠心肌細(xì)胞的線粒體形態(tài)和心肌細(xì)胞的功能[31,44]。P110選擇性地抑制過度的但不是基礎(chǔ)的線粒體分裂[45]，從而允許正常的線粒體自噬發(fā)生。對(duì)R6/2小鼠給予P110 3 mg/(kg·d)8周，心肌線粒體結(jié)構(gòu)顯著改善，控制了增加的線粒體Drp1水平，并減少線粒體積聚[45]。P110不影響Drp1與另外2個(gè)線粒體接頭蛋白Mff和MiD51的相互作用，也不影響與線粒體融合蛋白Mfn1或Mfn2的相互作用[43]。用P110對(duì)野生型小鼠進(jìn)行5個(gè)月的治療是安全的，對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)或功能沒有影響[46-47]。Drp1適配器蛋白可以為線粒體動(dòng)力學(xué)失調(diào)引起的疾病提供新的治療策略，這可能成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的誘人目標(biāo)[48]。此外，P110被發(fā)現(xiàn)能夠抑制ROS的產(chǎn)生，恢復(fù)線粒體膜電位和線粒體嵴的整合，并通過阻止Drp1移位到線粒體來防止線粒體腫脹，維持線粒體的完整性[33,43,49]。Dynasore是一種內(nèi)吞途徑的動(dòng)力蛋白GTPase抑制劑。Dynasore預(yù)處理培養(yǎng)的細(xì)胞可以保護(hù)其免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體分裂[41]，通過在應(yīng)激細(xì)胞中維持線粒體形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)ATP的機(jī)制來保護(hù)心臟免受心肌震顫和限制細(xì)胞損傷[31]。

2.1.2 改善I/R損傷引起的線粒體融合障礙 融合是線粒體的一種主要質(zhì)量控制機(jī)制，它使基質(zhì)成分能夠混合，允許受損線粒體的功能互補(bǔ)[50]?；钴S的線粒體融合對(duì)于維持線粒體的完整性和減少線粒體ROS的產(chǎn)生非常重要。增加線粒體融合的發(fā)生率為線粒體相關(guān)疾病如I/R損傷提供了一個(gè)新的治療方向[51]。

BGP-15是一種羥胺衍生物，具有廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用[52]。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BGP-15觸發(fā)的線粒體融合需要激活的OPA1、Mfn1/2和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt），預(yù)防ROS誘導(dǎo)的線粒體斷裂需要存在活躍的外膜和內(nèi)膜融合機(jī)制[51]。此外，Szabo等[51]還發(fā)現(xiàn)BGP-15能夠激活OPA1 GTPase并促進(jìn)其在體外的聚合，以一種獨(dú)特的方式引起OPA1的GTP水解，促進(jìn)線粒體融合，并穩(wěn)定線粒體內(nèi)的嵴膜。在Gai等[53]的研究中，與1-甲基-4-苯基-吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridiniumion，MPP+）處理的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞相比，大補(bǔ)陰丸和牽正散處理后均能部分阻止MPP+誘導(dǎo)的Drp1和Fis1的升高以及Mfn1、Mfn2和OPA1的降低，通過維持線粒體動(dòng)態(tài)平衡來改善線粒體損傷。

人參皂苷Rg1是人參二醇單體皂苷之一，被認(rèn)為是人參的主要藥理活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[54]。Dong等[54]利用心肌H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia reoxygenation，H/R）體外模型研究了人參皂苷Rg1對(duì)H/R心肌細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)的影響。人參皂苷Rg1在6.25～100 μmol/L內(nèi)呈劑量相關(guān)性地增加細(xì)胞抗缺氧再灌注損傷的存活，這與人參皂苷Rg1已有的心肌保護(hù)作用一致。與對(duì)照組相比，人參皂苷Rg1處理顯著增加了H9c2細(xì)胞Mfn2蛋白的表達(dá)，并呈劑量相關(guān)性地上調(diào)Mfn2mRNA含量。相反，人參皂苷Rg1對(duì)Mfn1、OPA1、Drp1的蛋白表達(dá)或mRNA水平?jīng)]有顯著影響。這些數(shù)據(jù)顯示人參皂苷Rg1是通過增加Mfn2表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)線粒體的重構(gòu)，達(dá)到對(duì)心肌H/R損傷的保護(hù)作用[54]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植是一種潛在的心血管疾病治療方法。低氧預(yù)適應(yīng)可以提高M(jìn)SCs的存活率，瘦素通過增加OPA1依賴的線粒體融合在低氧預(yù)適應(yīng)增強(qiáng)MSCs存活中起關(guān)鍵作用。通過OMA1泛素化增加L-OPA1的積聚，從而誘導(dǎo)線粒體融合，阻止MSCs的凋亡[55]。

2.2 藥物治療：激活線粒體自噬

自噬缺陷會(huì)導(dǎo)致廢棄線粒體的積累和細(xì)胞凋亡，從而增加心肌梗死范圍，惡化心室功能[6]。在大多數(shù)情況下，線粒體自噬被認(rèn)為是一種保護(hù)或適應(yīng)機(jī)制，因?yàn)樗心芰η宄齀/R損傷中積累的有缺陷的線粒體[6]。

辛伐他汀處理的心肌HL-1細(xì)胞激活了線粒體分裂和自噬過程，出現(xiàn)Parkin和p62向線粒體易位。通過上調(diào)Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬來減少遭受I/R損傷的野生型小鼠的梗死范圍，這是在Parkin基因敲除的小鼠中沒有觀察到的現(xiàn)象[6,56]。七氟醚預(yù)處理和后處理已被證明對(duì)I/R損傷具有保護(hù)作用[57-58]。七氟醚后處理治療不需要任何缺血事件的先驗(yàn)信息，在臨床環(huán)境中比七氟醚預(yù)處理更方便。與I/R組比較，七氟醚后處理組能顯著抑制I/R損傷引起的OPA1下降和Drp1、Parkin升高，降低微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3-Ⅱ/I）比值，抑制Beclin1、自噬相關(guān)基因（autophagy related genes，Atg）5和Atg7的表達(dá)。七氟醚后處理誘導(dǎo)的線粒體自噬可作為一種促進(jìn)生存的機(jī)制，防止I/R損傷的進(jìn)一步發(fā)展[59]。具有多種治療作用的白藜蘆醇能夠顯著上調(diào)D-半乳糖作用下H9c2細(xì)胞Drp1和線粒體自噬蛋白LC3-II的表達(dá)，增加Parkin和PINK1的線粒體易位[60]，通過Drp1-parkin-PINK1信號(hào)調(diào)節(jié)線粒體碎片和線粒體自噬，以清除不健康的心臟線粒體。盡管白藜蘆醇預(yù)處理可有效預(yù)防心肌線粒體功能障礙，但白藜蘆醇對(duì)心肌線粒體動(dòng)力學(xué)和線粒體自噬的有利作用僅在高劑量（10 mg/kg）白藜蘆醇處理的H9c2細(xì)胞中觀察到[61]。天麻素是從天麻屬植物天麻中提取的一種單體成分，對(duì)心肌I/R損傷有保護(hù)作用[62]。天麻素預(yù)處理通過AMPK-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路誘導(dǎo)了 I/R期間自噬的發(fā)生，包括 p-AMPK/AMPK的比值升高，p-mTOR/mTOR的比值降低，LC3-II的表達(dá)下調(diào)以及p62表達(dá)的增加。自噬和凋亡之間的競(jìng)爭關(guān)系可能是天麻素減少凋亡的重要因素。與I/R模型組的小鼠相比，天麻素預(yù)處理小鼠的心肌梗死面積明顯縮小，心功能有所提高[62]。

2.3 藥物治療：促進(jìn)線粒體生物發(fā)生

線粒體生物發(fā)生相關(guān)信號(hào)的紊亂與人類心血管疾病發(fā)生相關(guān)。線粒體的生物發(fā)生是在病理?xiàng)l件下試圖改善生物能量學(xué)參數(shù)和細(xì)胞質(zhì)量的潛在藥理靶點(diǎn)[63]。瘦素通過激活線粒體生物發(fā)生的主要調(diào)控因子PGC-1α的表達(dá)以及新線粒體形成所必需的另一個(gè)重要因子線粒體單鏈DNA結(jié)合蛋白表達(dá)水平來增加mtDNA復(fù)制，以提高生物能量產(chǎn)生效率[64]。七氟醚是一種常用的揮發(fā)性麻醉劑，已在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中表現(xiàn)出了對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用[65-66]。臨床上，七氟醚后處理在再灌注開始時(shí)立即實(shí)施比麻醉預(yù)處理更有吸引力，因?yàn)楹蟾深A(yù)可以在再灌注時(shí)進(jìn)行，而不必預(yù)測(cè)缺血發(fā)作[67]。七氟醚后處理持續(xù)給藥后，可顯著提高線粒體功能相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平，線粒體蛋白Nrf-1和PGC-1α的表達(dá)顯著上調(diào)[59]。褪黑素已被證明在各種心血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用[68-69]，對(duì)線粒體功能的影響是多方面的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其對(duì)線粒體動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)。褪黑素在病理?xiàng)l件下增加了PGC-1α的表達(dá)，并促進(jìn)了線粒體的生物發(fā)生。同時(shí)，PGC-1α通過與Drp1啟動(dòng)子結(jié)合直接負(fù)向調(diào)節(jié)DRP1的表達(dá)，阻止線粒體分裂，進(jìn)一步發(fā)揮心肌保護(hù)作用[70]。具有心臟保護(hù)作用的白藜蘆醇也被發(fā)現(xiàn)通過激活A(yù)MPK-PGC-1α-雌激素受體相關(guān)受體α（estrogen receptor related receptorα，ERRα）信號(hào)以依賴于沉默信息調(diào)節(jié)因子3的方式調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生，從而顯示出對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[71]。PGC-1α被稱為線粒體生物發(fā)生的“分子開關(guān)”[72]，目前大多數(shù)被研究的治療藥物集中在激活PGC-1α及其靶基因上，以待激活線粒體生物發(fā)生過程，改善I/R損傷背景下的能量危機(jī)。

不同治療藥物參與線粒體質(zhì)量控制體系的作用見表1。

表1 不同治療藥物參與線粒體質(zhì)量控制體系的作用Table 1 Role of different therapeutic agents in mitochondrial quality control system

2.4 運(yùn)用分子生物學(xué)手段：蛋白靶向降解嵌合體的引入

蛋白質(zhì)的泛素化是細(xì)胞翻譯后修飾的一種，通過在底物上添加泛素部分而實(shí)現(xiàn)[73]。E3連接酶在這個(gè)酶級(jí)聯(lián)中起著極其重要的作用，因?yàn)樗麄円x擇被修飾的特定底物[74]。維持蛋白平衡的關(guān)鍵因子是一個(gè)稱為泛素的小蛋白分子。當(dāng)它被鏈接到蛋白上后，會(huì)導(dǎo)致這些蛋白被運(yùn)送到蛋白酶體中進(jìn)行降解。作為近年來生物化學(xué)研究的重大成果之一，泛素化成為研究、開發(fā)新藥物的新靶點(diǎn)。

蛋白靶向降解是藥物研發(fā)領(lǐng)域的一個(gè)新興方向，有別于傳統(tǒng)小分子是通過阻斷蛋白功能來發(fā)揮作用。蛋白靶向降解嵌合體（proteolytic targeting chimera，PROTAC）分子在進(jìn)入細(xì)胞后，其結(jié)構(gòu)中的目標(biāo)蛋白（protein of interest，POI）配體可特異性地與相應(yīng)的靶蛋白結(jié)合，而另一端可以募集E3連接酶從而形成POI-PROTAC-E3 ligase三元復(fù)合物，其中E3連接酶可介導(dǎo)泛素結(jié)合酶E2對(duì)POI泛素化。三元復(fù)合物解離后，被泛素標(biāo)記的POI被蛋白酶體識(shí)別并降解從而選擇性地降低靶蛋白的水平。此過程無需靶蛋白配體長時(shí)間占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)，只需三元復(fù)合物短暫的形成便可瞬時(shí)完成目標(biāo)蛋白的泛素化，并且PROTAC在細(xì)胞內(nèi)可多次循環(huán)發(fā)揮作用。由于蛋白靶向降解策略，不需要直接抑制目標(biāo)蛋白的功能活性，藥物不需要與目標(biāo)蛋白長時(shí)間和高強(qiáng)度的結(jié)合來達(dá)到選擇性降解蛋白的目的，因此理論上這個(gè)策略可以用于任何一個(gè)蛋白質(zhì)。在基因編輯、細(xì)胞治療新技術(shù)層出不窮的今天，PROTAC技術(shù)作為一種全新的藥物發(fā)現(xiàn)策略，對(duì)于新藥的開發(fā)意義重大。

受到PROTAC的啟發(fā)，有必要開始利用PROTAC介導(dǎo)的降解來消除I/R損傷中參與病理形成過程的線粒體質(zhì)量控制蛋白[75]，靶向線粒體病理改變是對(duì)抗I/R損傷的一種有前途的策略[76-77]。利用已有的臨床和非臨床藥物篩選合適的PROTAC，根據(jù)線粒體自噬已知的途徑探討現(xiàn)有E3的底物范圍，設(shè)計(jì)正確的臨床方案。如基于高分辨質(zhì)譜，在一個(gè)化合物池/庫中篩選分析成千上萬個(gè)化合物，提高篩選通量。應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)配體時(shí)，該方法能夠從高復(fù)雜性的化合物池中重復(fù)鑒定出高親和力靶標(biāo)。通過該篩選方案，利用不同的E3連接酶突變體，進(jìn)行多輪篩選，可解決E3連接酶突變帶來的PROTAC分子耐藥性問題。PROTAC技術(shù)以其全新的藥理學(xué)作用模式，及其所帶來的諸多優(yōu)勢(shì)，展現(xiàn)出了在小分子藥物開發(fā)領(lǐng)域極為廣闊的應(yīng)用前景。PROTAC技術(shù)示意圖見圖2。

圖2 PROTAC技術(shù)示意圖Fig.2 Schematic diagram of PROTAC

2.5 線粒體移植

替代目前心臟保護(hù)方案的另一種治療措施是替換缺血和再灌注期間受損的線粒體。再灌注前被證明是挽救心肌組織和恢復(fù)/增強(qiáng)心肌功能的關(guān)鍵時(shí)期[78-79]。從未受缺血影響的組織中分離出新鮮的呼吸能力強(qiáng)的線粒體，然后在再灌注前注射到缺血區(qū)[75]，這是否能獲得局部或整體缺血后心功能恢復(fù)的強(qiáng)大受益[80]？為了提高這一有希望的新治療策略的臨床適用性，Cowan等[80]開始研究將外源性線粒體運(yùn)送到受損心臟的替代方法。對(duì)Langendorff灌流的兔心進(jìn)行30 min的缺血，然后再灌注10 min。利用羅丹明6G熒光染料對(duì)線粒體進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記的線粒體直接注射到缺血區(qū)域，或在再灌注開始時(shí)通過冠狀動(dòng)脈進(jìn)行血管灌注。注射的線粒體定位于注射部位附近，而血管灌注的線粒體導(dǎo)致迅速而廣泛的彌散在心臟各處[80]。通過血管灌注傳遞的線粒體顯著增強(qiáng)了整體和局部心肌功能，再灌注結(jié)束時(shí)測(cè)得的梗死面積也通過血管灌注自體線粒體而顯著減少。這些發(fā)現(xiàn)有助于增加這項(xiàng)技術(shù)在心肌梗死后冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)和血運(yùn)重建的臨床應(yīng)用[81]。線粒體移植示意圖見圖3。

圖3 線粒體移植示意圖Fig.3 Schematic diagram of mitochondrial transplantation

為了提高臨床實(shí)用性和減少免疫原性并發(fā)癥，應(yīng)從同一有機(jī)體（自體）中的遠(yuǎn)程非缺血組織中分離線粒體以移植到心肌缺血區(qū)[82]。在體兔局部心肌缺血再灌注模型中，從同一生物的胸大肌中分離出自體線粒體，并在缺血29 min后，再灌注前立即注入心肌[83]。結(jié)果表明，線粒體移植可顯著縮小心肌梗死面積，提高心肌細(xì)胞活力，恢復(fù)4周時(shí)的心功能。此外，通過多重實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，自體線粒體移植沒有誘導(dǎo)任何自身免疫[83]，沒有顯示與心臟移植排斥反應(yīng)相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子的增加。來自相同個(gè)體不同組織類型及其亞群（肌膜下或纖維間）的移植線粒體的心肌保護(hù)作用沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異[84]。Bertero等[85]從自體骨骼肌及人心肌成纖維細(xì)胞分離線粒體，于再灌注前1 min經(jīng)心外膜注入缺血心臟[83-84]或再灌注后即刻經(jīng)冠狀動(dòng)脈血管灌注[81]。在10 min內(nèi)，注意到左心室血流動(dòng)力學(xué)的改善，ATP含量在數(shù)小時(shí)內(nèi)得到提高，這樣的治療效益甚至維持到了再灌注后21～28 d[80,83-84]。這一系列的研究結(jié)果表明，線粒體移植為缺血性心臟病的心臟保護(hù)提供了一種有價(jià)值的策略，并為深入了解線粒體的功能和治療潛力打開了大門[82]。

3 結(jié)語與展望

心肌細(xì)胞由于其高能量利用率和無儲(chǔ)備，特別容易受到缺血的影響[60]。線粒體適應(yīng)多種生理需求，匯聚應(yīng)激反應(yīng)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡[86-87]，是疾病期間細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者[88]，是未來研究心肌I/R損傷的潛在治療靶點(diǎn)[5]。到目前為止，還沒有常規(guī)臨床藥物來保護(hù)心肌免受I/R損傷[89]。因此，需要新的治療方法來減少梗死面積，并可以作為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的輔助治療，以提高患者的存活率和防止心力衰竭的發(fā)生[90]。一般說來，心肌保護(hù)的方法要么是聯(lián)合的，要么是間接的，強(qiáng)調(diào)單一的機(jī)械路線或復(fù)合體，或使用激活劑或抑制劑，或作為單一的治療方法，或與其他方法結(jié)合使用。根據(jù)目前已經(jīng)進(jìn)行的研究成果，發(fā)現(xiàn)成功的對(duì)再灌注損傷的臨床干預(yù)很可能需要補(bǔ)充治療，在整個(gè)心肌恢復(fù)過程中處理不同的心臟損傷機(jī)制[3]。無論是單獨(dú)使用還是聯(lián)合使用，在很大程度上都有利于推動(dòng)I/R損傷治療方式的進(jìn)一步完善。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突