基于ITS2條形碼鑒別南大青葉的PCR-RFLP研究

黃韻璇，朱曉燕，侯惠嬋，陳偉盛

廣州市藥品檢驗(yàn)所 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510000

歷史上使用的“大青葉”來源有4個(gè)基原，分別為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigoticaFort.的干燥葉、蓼科植物蓼藍(lán)Polygonum tinctoriumAit.的干燥葉、爵床科植物馬藍(lán)Baphicacanthus cusia(Nees) Bremek.的干燥葉、馬鞭草科大青Clerodendrum cyrtophyllumTurcz.的干燥葉。其中，菘藍(lán)的干燥葉和蓼藍(lán)干燥葉分別以“大青葉”和“蓼大青葉”收載在《中國(guó)藥典》2020年版；馬藍(lán)干燥葉以“大青葉”收載在《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1987年版和《廣東省中藥炮制規(guī)范》1984年版；大青干燥葉以“大青葉（馬大青葉）”收載在《湖南省藥材標(biāo)準(zhǔn)》2009年版。在《中國(guó)藥典》2020年版一部中，菘藍(lán)的干燥根和干燥葉分別被收載為“板藍(lán)根”和“大青葉”[1]，而馬藍(lán)的干燥根莖和根被收載為“南板藍(lán)根”[1]，本實(shí)驗(yàn)所述“南大青葉”為爵床科植物馬藍(lán)的干燥葉。

馬藍(lán)為草本植物，主要分布于我國(guó)華南、西南和華東地區(qū)，由于馬藍(lán)產(chǎn)量限制與各地區(qū)的使用習(xí)慣不同，市售的南大青葉易為同科混偽品（如球花馬藍(lán)葉、廣西馬藍(lán)葉、疏花馬藍(lán)葉、少花馬藍(lán)葉等）或不同科屬的大青葉和菘藍(lán)葉等[2]。傳統(tǒng)的顯微鑒別和化學(xué)鑒別易受基原植物的生長(zhǎng)環(huán)境影響[3]，而且對(duì)操作人員的技術(shù)背景有一定要求，鑒別結(jié)果準(zhǔn)確度不高。因此，采用基于DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)的分子鑒別方法作為傳統(tǒng)鑒別手段的補(bǔ)充，可以有效降低南大青葉的鑒別難度，加強(qiáng)基原物種馬藍(lán)相關(guān)藥材、飲片和中成藥的質(zhì)量監(jiān)管，提高民眾用藥安全[4]。

DNA條形碼技術(shù)是通過一段短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列進(jìn)行物種鑒定的分子技術(shù)，鑒定結(jié)果不受物種個(gè)體形態(tài)特征和發(fā)育階段的影響，操作流程簡(jiǎn)單規(guī)范，不過度依賴操作人員的經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過近些年的發(fā)展已廣泛應(yīng)用于海關(guān)、法醫(yī)、動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫、食品、藥品及化妝品檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域[5]。在中藥材鑒定方面，陳士林團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建了基于ITS2、psbA-trnH、COI的DNA條形碼生物鑒定體系[6]，并且該方法已納入《中國(guó)藥典》2020年版，收載的中藥材中，川貝母的鑒別項(xiàng)下包含了基于ITS1條形碼測(cè)序分析的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）法[1]。該方法是針對(duì)限制性酶切位點(diǎn)限制性片段長(zhǎng)度變異的一種常用的生物基因型鑒定方法，它在PCR的基礎(chǔ)上利用限制性內(nèi)切酶和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)能準(zhǔn)確區(qū)別川貝母與其混偽品。

參照《中國(guó)藥典》2020年版四部中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則，選用ITS2序列為主體序列，以葉綠體psbA-trnH為輔助序列，對(duì)36批南大青葉樣品進(jìn)行序列比對(duì)，探索馬藍(lán)與其近緣種在分子水平上的差異。并且，通過分析馬藍(lán)及其近緣物種的DNA條形碼位點(diǎn)差異，建立南大青葉基于ITS2基因和限制性內(nèi)切酶Sma I的PCR-RFLP鑒別方法。

1 材料與儀器

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)用36批南大青葉藥材信息見表1。其中，陽(yáng)性對(duì)照藥材P2～P4和P6～P15為自采樣本，經(jīng)廣州市藥品檢驗(yàn)所中藥室侯惠嬋主任中藥師鑒定為馬藍(lán)B.cusia(Nees) Bremek.；陰性對(duì)照藥材N14、N16～N21樣品分別為爵床科垂序馬藍(lán)Strobilanthes japonicus(Thunb.) Miq.、爵床科艷蘆莉Ruellia elegansPoir.、爵床科翠蘆莉R.simplexC.Wright.、爵床科狗肝菜Dicliptera chinensis(L.) Juss.、爵床科云南山殼骨Pseuderanthemum crenulatu(Wallich ex Lindley) Radlkofer.疑似品、馬鞭草科大青C.cyrtophyliumTurcz.和十字花科菘藍(lán)I.indigoticaFortune.。

表1 36批南大青葉樣品編號(hào)和來源信息Table 1 Serial number and source of 36 batches of materials

1.2 儀器和試劑

SIGMA 1-14K型高速離心機(jī)（美國(guó)SIGMA公司）；水浴搖床WNB14（德國(guó)Memmert公司）；PCR擴(kuò)增儀9700（美國(guó)AB Applied Biosystems公司）；分析天平PM200（瑞士Mettler Toledo公司）；凝膠成像系統(tǒng)GelDoc XR＋（美國(guó)Bio-Rad公司）；組織粉碎儀pulverisette23（德國(guó)IKA公司）。

植物基因組DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini Ki（QIAGEN）；PrimeSTAR Max Premix（Takara Bio）；DL 2000 DNA Marker（Takara Bio）；Gelred染料（Biotium）；Sma I Fastdigest（ThermoSciense）；ITS2序列正向引物ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向引物ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’（華大基因）；psbA-trnH序列正向引物psbAF：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’，反向引物trnHR：5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’（華大基因）。

2 方法

2.1 DNA的提取

取樣品約20 mg，置組織粉碎儀中制成細(xì)粉，按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣品DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增ITS2和psbA-trnH分別使用ITS2R/ITS3F和fwd/rev引物對(duì)，反應(yīng)總體積為20 μL，DNA模板加入量為0.5～1.0 ng，反應(yīng)參數(shù)為98 ℃預(yù)變性30秒，循環(huán)反應(yīng)30次（98 ℃、10 s，56 ℃、15 s、72 ℃、20 s），72 ℃延伸5 min。

2.3 測(cè)序與比對(duì)分析

將PCR產(chǎn)物委托華大基因進(jìn)行正反向測(cè)序，測(cè)序引物為PCR反應(yīng)引物。獲得的雙向測(cè)序峰圖文件利用SeqMan軟件進(jìn)行序列拼接，再去除測(cè)序結(jié)果兩端信號(hào)弱或重疊峰區(qū)域，使序列方向與PCR擴(kuò)增正向引物方向一致。拼接的序列使用基于隱馬爾科夫模型的 ITS2注釋網(wǎng)站（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de）進(jìn)行標(biāo)注[7]，再在MEGA 10.0.5軟件上采用Clustal W方法比對(duì)分析樣品序列，繪制Neighbor-joining（N-J進(jìn)化樹）。

2.4 Sma I酶切反應(yīng)

酶切反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)體系包括10×酶切緩沖液2 μL，PCR反應(yīng)液10 μL，Sma I 0.5 μL，無菌水7.5 μL，反應(yīng)在37 ℃水浴進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 南大青葉及其混偽品的DNA條形碼鑒定

參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則9107中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則，選用ITS2為主體序列，葉綠體psbA-trnH為輔助序列對(duì)36批樣品進(jìn)行分子鑒定。所有樣品的DNA條形碼片段均成功擴(kuò)增，psbA-trnH測(cè)序得到約510 bp的序列信息，而含有重復(fù)GC片段的ITS2序列難以測(cè)通，經(jīng)過拼接和去除信號(hào)弱的區(qū)域僅得到大小約為300 bp、包含28S motif區(qū)域的片段序列。

將所有樣品ITS2基因的可測(cè)序部分的序列用Clustal W方法分析比對(duì)繪制N-J進(jìn)化樹（圖1），再將樣品序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)（表2），結(jié)果顯示P1～P15樣品與馬藍(lán)的相應(yīng)序列完全一致；N1～N10樣品與馬藍(lán)的ITS2序列存在位點(diǎn)差異，相似度為96%；N13～N15樣品與馬藍(lán)ITS2序列的差異位點(diǎn)較多，相似度為93%，而且在進(jìn)化樹上表現(xiàn)為屬于P1～P15和N1～N12的外群；N16～N21樣品與其他物種ITS2序列較一致，與馬藍(lán)的序列差異較大。另外，將P1～P15、N1、N3、N9、N15樣品的psbA-trnH序列進(jìn)行比對(duì)，P1～P15與N9無位點(diǎn)差異，N1、N3、N15與其他序列僅有2個(gè)位點(diǎn)的差異，說明psbA-trnH不適用于馬藍(lán)鑒定。因此，上述36批樣品按中藥材DNA條形碼分子鑒定，P1～P15的物種鑒定為馬藍(lán)，為南大青葉正品，N1～N15的物種鑒定為馬藍(lán)同科近緣物種，為南大青葉混偽品，N16～N21為其他科屬物種，為南大青葉混偽品。

表2 36批樣品ITS2部分序列的BLAST比對(duì)結(jié)果Table 2 BLAST result based on part of ITS2 sequeces of 36 samples

圖1 基于36批樣品部分ITS2序列的N-J進(jìn)化樹Fig.1 N-J tree based on part of ITS2 sequences of 36 samples

3.2 南大青葉PCR-RFLP法鑒別方法建立

根據(jù)所有樣品ITS2的測(cè)序結(jié)果，南大青葉正品比對(duì)混偽品有2個(gè)穩(wěn)定的關(guān)鍵差異位點(diǎn)（圖2），其中一個(gè)位點(diǎn)在限制性內(nèi)切酶Sma I的識(shí)別區(qū)域CCCGGG中，即南大青葉ITS2基因擴(kuò)增產(chǎn)物約500 bp，經(jīng)Sma I酶切可形成2條大小分別約為200 bp和300 bp的DNA片段，以此可建立相應(yīng)的南大青葉PCR-RFLP鑒別方法。另外，按中藥材DNA條形碼鑒定指導(dǎo)原則采用56 ℃退火溫度擴(kuò)增南大青葉樣品的ITS2基因，擴(kuò)增產(chǎn)物在300 bp位置有非特異性條帶影響酶切后目的條帶的觀察，因此使用58 ℃的退火溫度進(jìn)行PCR-RFLP反應(yīng)更適用于南大青葉的鑒別。

圖2 限制性內(nèi)切酶Sma I在馬藍(lán)ITS2基因序列中的識(shí)別位點(diǎn)示意圖Fig.2 Recognition site of restriction enzyme Sma I in ITS2 sequences of B.cusia and its adulterants

3.3 南大青葉PCR-RFLP法鑒別方法驗(yàn)證

按《中國(guó)藥典》2020年版四部9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則分別考察上述PCRRFLP鑒別方法的專屬性和耐用性。

3.3.1 專屬性試驗(yàn) 按“2.1”“2.2”項(xiàng)對(duì)36批樣品進(jìn)行DNA提取，利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增樣品ITS2基因，退火溫度為58 ℃，然后用Sma I Fastdigest酶切PCR產(chǎn)物，反應(yīng)15 min，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，南大青葉正品P1～P15在200～300 bp位置有2個(gè)明亮的酶切的條帶，均呈陽(yáng)性反應(yīng)；南大青葉混偽品N1～N21和空白對(duì)照在200～300 bp處無條帶，均呈陰性反應(yīng)（圖3）。結(jié)果說明上述PCR-RFLP方法用于鑒別南大青葉符合《中國(guó)藥典》2020年版四部9101專屬性的要求。

圖3 36批南大青葉樣品PCR-RFLP鑒別結(jié)果Fig.3 Identification result of 36 batches of samples with PCR-RFLP method

3.3.2 耐用性試驗(yàn) 取3批南大青葉正品和3批南大青葉混偽品按上述PCR-RFLP反應(yīng)進(jìn)行鑒別，分別使用與專屬性試驗(yàn)不同的植物DNA提取試劑盒（北京天根、北京中科瑞泰）、ITS2通用引物（Invitrogen）、退火溫度（60 ℃）、DNA聚合酶（Promega GoTaq?DNA聚合酶、Promega Taq DNA聚合酶）、Sma I限制性內(nèi)切酶（Promega、ThermoSciense）和1 h酶切反應(yīng)時(shí)間，各反應(yīng)體系與條件參考商品化試劑說明書。結(jié)果顯示，所有樣品的在500 bp的位置均有PCR產(chǎn)物條帶；南大青葉正品的酶切產(chǎn)物在200～300 bp位置有2個(gè)酶切條帶，呈陽(yáng)性反應(yīng)；南大青葉混偽品無酶切條帶，呈陰性反應(yīng)（圖4）。因此，上述PCR-RFLP方法用于鑒別南大青葉符合《中國(guó)藥典》2020年版四部9101耐用性的要求。

圖4 PCR-RFLP法鑒別南大青葉的耐用性考察Fig.4 Robustness of PCR-RFLP identification method with B.cusia

4 討論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)南大青葉鑒別建立的PCR-RFLP方法是基于DNA分子條形碼ITS2的分析應(yīng)用。經(jīng)過對(duì)36批中藥材南大青葉及混偽品的序列分析，南大青葉所屬物種馬藍(lán)的ITS2序列與疏花馬藍(lán)、關(guān)節(jié)馬藍(lán)、垂序馬藍(lán)等近緣物種的有明顯的位點(diǎn)差異，與艷蘆莉、翠蘆莉、狗肝菜、云南山殼骨、大青和菘藍(lán)等混偽品的有較大種間差異。而且，黃志海等[8]分析馬藍(lán)、菘藍(lán)、蓼藍(lán)和大青的ITS2條形碼序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)物種在N-J進(jìn)化樹上也能明顯區(qū)分。因此，ITS2作為鑒定馬藍(lán)的DNA分子條形碼具備良好的適用性。凃媛[9]針對(duì)馬藍(lán)、蓼藍(lán)和菘藍(lán)等含靛玉紅類中藥材的4種DNA條形碼序列進(jìn)行了擴(kuò)增分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITS2序列的擴(kuò)增效率及測(cè)序成功率較低，進(jìn)而采用T-A克隆法獲得高質(zhì)量測(cè)序結(jié)果。蔣超等[10]采用堿裂法提取各類藥材DNA發(fā)現(xiàn)來自植物葉樣品的DNA純度比根和莖的較高，但PCR擴(kuò)增效率最低。本研究采用硅膠膜吸附柱和離心柱法提取干燥葉樣品中的基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定所得DNA溶液純度較低，在260 nm吸光度值較大，直接用作模板會(huì)影響擴(kuò)增效率或?qū)е聰U(kuò)增失敗。但是，用適量無菌純化水將模板DNA稀釋后再加入PCR反應(yīng)體系中，所有樣品的ITS2序列均能成功擴(kuò)增，表明采用簡(jiǎn)單的稀釋模板步驟可提高中藥材DNA序列的擴(kuò)增效率，減少植物中多糖、多酚和部分次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的抑制作用。

在《中國(guó)藥典》2020年版一部的收載品種中，南板藍(lán)根為馬藍(lán)的干燥根莖或根，青黛為馬藍(lán)、蓼藍(lán)或菘藍(lán)的葉或莖葉經(jīng)加工制成的干燥粉末、塊團(tuán)或顆粒，二者采用的鑒別方法為顯微鑒別、化學(xué)鑒別和針對(duì)靛藍(lán)與靛玉紅的薄層色譜法[1]。本研究建立的PCR-RFLP法對(duì)馬藍(lán)物種的鑒別具有良好的專屬性和耐用性，因此同樣適用于鑒別南板藍(lán)根，方法快捷高效，結(jié)果準(zhǔn)確，有效彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的鑒別手段主觀性強(qiáng)、準(zhǔn)確性低、樣品用量大等不足。同時(shí)，魏藝聰?shù)萚11]通過對(duì)20條樣本信息的SNP分析發(fā)現(xiàn)matK序列可以用于鑒別馬藍(lán)和大青，但本研究表明馬藍(lán)與其近緣物種的psbA-trnH基因不存在明顯的變異位點(diǎn)，因此基于DNA條形碼分子技術(shù)建立相應(yīng)的鑒定體系，在鑒別中藥材青黛方面也有著重要的應(yīng)用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突