UFLC-MS/MS法同時測定寧泌泰膠囊中沒食子酸、連翹苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和槲皮素在大鼠血漿中的含量

陳銀梅，朱啟洪，宿貴鵬

六盤水市婦幼保健院，貴州 六盤水 553000

寧泌泰膠囊系苗藥，收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（試行）WS-10348-(ZD-0348)-2002，由四季紅、白茅根、大風(fēng)藤、三棵針、仙鶴草、芙蓉葉、連翹7味中藥組成，具有清熱解毒、利濕通淋的功效，用于治療濕熱蘊結(jié)所致淋證如小便不利、淋漓澀痛、尿血以及下尿路感染、慢性前列腺炎癥[1]。目前的報道主要集中于寧泌泰膠囊中活性成分的含量測定[2-5]。本研究建立了快速、靈敏的超快速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UFLC-MS/MS）方法，對寧泌泰膠囊中沒食子酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、連翹苷、槲皮素同步進(jìn)行定量測定，并對以上5種成分在大鼠血漿中的藥動學(xué)進(jìn)行研究，為明確寧泌泰膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量（220±20）g，6周齡，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK（滬）2014-0009-0016。動物于溫度（20～25）℃、濕度40%～70%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。所有動物實驗遵循國家有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

寧泌泰膠囊（0.38 g/粒，批號2019R000356）購自貴陽新天藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)UFLC-MS/MS測定含沒食子酸1 620.3 μg/g、連翹苷790.1 μg/g、鹽酸小檗堿312.4 μg/g、鹽酸巴馬汀135.2 μg/g、槲皮素234.6 μg/g；鹽酸巴馬汀對照品（批號Z16J10X79792，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自上海源葉生物科技有限公司；對照品鹽酸小檗堿（批號110713-200609）、沒食子酸（批號110831-201906）、槲皮素（批號100081-200907）、對乙酰氨基酚（批號100018-201409）購自中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%；連翹苷（批號487-41-2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自上海同田生物技術(shù)有限公司；色譜級甲醇和乙腈購自美國Thermo Fisher Scientific公司；色譜級甲酸購自美國Sigma公司；超純水由Millipore純水儀制備。

1.3 儀器

LCMS-8050型UFLC-MS/MS儀（日本島津公司）；5414R型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；BP211D型精密電子天平（德國Sartorius公司）；VX200型多功能渦旋振蕩器（美國Labonco公司）；KQ-250DB型高頻恒溫超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷、沒食子酸、槲皮素對照品各10 mg于10 mL量瓶中，加甲醇定容，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲備液。分別取10 μL 5個化合物的儲備液，加入950 μL甲醇，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合對照品儲備液。用甲醇將混合對照品儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合對照品溶液。取1 μg/mL混合對照品溶液，分別吸取適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL的混合對照品系列溶液，于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩Ａ砦湟哼m量用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為2、50、400 ng/mL的質(zhì)控樣品。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱定對乙酰氨基酚對照品5.00 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液。取該溶液適量，以甲醇稀釋為質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 給藥溶液的配制 取寧泌泰膠囊內(nèi)容物，稱定質(zhì)量，加入一定量的超純水，分別配制成質(zhì)量濃度為0.05、0.20 g/mL的混懸溶液，用于ig給藥。分別稱取鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷、沒食子酸和槲皮素對照品各2 mg，用含5%二甲基亞砜（DMSO）的0.9%氯化鈉溶液溶解，配制成含各化合物0.5 mg/mL的溶液用于iv給藥。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 Waters HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～2 min，2%～45% B；2～4 min，45%～98% B；4～5 min，98% B；體積流量為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫為40 ℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正、負(fù)離子模式；錐孔電壓正離子為3 kV，負(fù)離子為2.5 kV；離子源溫度為400 ℃；接口溫度為300 ℃；離子化氣體流量體積為3 L/min；干燥氣流量體積為10 L/min；加熱氣體積流量為10 L/min；采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）對鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷、沒食子酸、槲皮素5種成分及內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 5種化合物與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of five compounds and internal standard

2.3 血樣的采集

取16只SD大鼠分別ig寧泌泰膠囊（0.5、4.0 g/kg），連續(xù)7 d，分別于第1、7天給藥前及給藥后0.083、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、6.000、8.000 h取血0.3 mL，4000×g離心10 min，分離血漿。取8只SD大鼠iv藥物（1 mg/kg），于第1天給藥前和給藥后0.033、0.083、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、6.000、8.000 h取血0.3 mL，4000×g離心10 min，分離血漿。

2.4 血漿樣品的處理方法

前期對樣品的處理方法進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)血漿樣品用甲醇沉淀對鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷、槲皮素和內(nèi)標(biāo)的沉淀效果好，且無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，最終確定方法1作為鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷、槲皮素的樣品處理方法。由于方法1中沒食子酸的回收率較低，因此沒食子酸的分析按方法2的樣品處理方法進(jìn)行處理。

方法1：吸取大鼠血漿樣品100 μL，加入800 μL甲醇（含內(nèi)標(biāo)100 ng/mL）沉淀蛋白，13 000×g離心5 min，吸取上清液800 μL，氮氣吹干，加入100 μL甲醇-水（1∶1）復(fù)溶，渦旋混合1 min，13 000×g離心5 min，取上清液5 μL進(jìn)樣。

方法2：吸取大鼠血漿樣品100 μL，加入100 μL 2%甲酸水溶液，再加入800 μL甲醇（含內(nèi)標(biāo)100 ng/mL）沉淀蛋白，13 000×g離心5 min，吸取上清液800 μL，氮氣吹干，加入100 μL甲醇-水（1∶1）復(fù)溶，渦旋混合1 min，13 000×g離心5 min，取上清液5 μL進(jìn)樣。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗 取大鼠空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)溶液并補(bǔ)加相應(yīng)體積的甲醇外，其余按“2.4”項下方法處理，獲得空白血漿樣品色譜圖。取100 μL混合對照品溶液（0.5 ng/mL），37 ℃氮氣吹干后，加入100 μL空白血漿渦旋混勻，其余按“2.4”項下方法處理，獲得定量限生物樣品色譜圖。取給藥后30 min血漿樣品，按“2.4”項下方法處理，獲得給藥血漿樣品色譜圖。

2.5.2 線性范圍和定量限 精密移取各質(zhì)量濃度混合對照品溶液100 μL，37 ℃氮氣吹干后，加入100 μL空白血漿渦旋混勻，配制成含有各對照品質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL的含藥血漿，按“2.4”項下方法處理。以各化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），以加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法靈敏度以定量限表示，以S/N≥10時的質(zhì)量濃度作為方法的定量限，S/N≥3時的質(zhì)量濃度作為方法的檢測限。

2.5.3 準(zhǔn)確度和精密度 取空白血漿100 μL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法制備含各對照品質(zhì)量濃度分別為2、50、400 ng/mL的質(zhì)控樣品，每個濃度平行配制5份。按“2.4”項下方法處理，1 d內(nèi)測定3次，并連續(xù)測定3 d，記錄色譜圖，計算各化合物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，根據(jù)當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出實測質(zhì)量濃度及實測質(zhì)量濃度準(zhǔn)確度，計算日內(nèi)、日間精密度，計算實測質(zhì)量濃度與配制質(zhì)量濃度的比值，得出方法的準(zhǔn)確度。

2.5.4 提取回收率 精密移取各對照品的質(zhì)控樣品100 μL置1.5 mL離心管中，37 ℃氮氣吹干后，加入空白血漿100 μL，渦旋混勻，按“2.4”項下方法處理，取上清液5 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計算各質(zhì)量濃度樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值，每個質(zhì)量濃度平行制備5份。

另取空白血漿100 μL，按“2.4”項下方法處理，取上清液得空白血漿上清液。取混合對照品溶液100 μL，置1.5 mL離心管中，37 ℃氮氣吹干后，加入空白血漿上層清液100 μL，渦旋混勻后，吸取5 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計算各化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值，每個質(zhì)量濃度平行配制2份，計算提取回收率。

2.5.5 穩(wěn)定性

（1）短期穩(wěn)定性：精密移取各混合對照品溶液100 μL，37 ℃氮氣吹干后，加入空白血漿100 μL，配制成含各對照品質(zhì)量濃度為2、50、400 ng/mL的質(zhì)控樣品，于室溫下放置24 h后按“2.4”項下方法處理，每個濃度平行制備5份，記錄色譜圖，計算各化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算化合物的實測質(zhì)量濃度，計算實測質(zhì)量濃度與配制質(zhì)量濃度的比值，求得樣品短期穩(wěn)定性。

（2）長期穩(wěn)定性：精密移取各混合對照品溶液100 μL，37 ℃氮氣吹干后，加入空白血漿100 μL，配制成含各化合物質(zhì)量濃度為2、50、400 ng/mL的質(zhì)控樣品，于 -20 ℃放置14 d后按“2.4”項下方法處理，每個濃度平行制備5份，記錄色譜圖。計算各化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算化合物的實測質(zhì)量濃度，計算實測質(zhì)量濃度與配制質(zhì)量濃度的比值，求得樣品長期穩(wěn)定性。

（3）凍融穩(wěn)定性：精密移取各對照品溶液100 μL，37 ℃氮氣吹干后，加入空白血漿100 μL，配制成含各化合物質(zhì)量濃度為2、50、400 ng/mL的質(zhì)控樣品，于 -20 ℃儲存24 h，取出解凍，反復(fù)凍融3次后進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。計算各化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算化合物的實測質(zhì)量濃度，計算實測質(zhì)量濃度與配制質(zhì)量濃度的比值，求得樣品凍融穩(wěn)定性。

（4）樣品在進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性：精密移取各對照品溶液100 μL，37 ℃氮氣吹干后，加入空白血漿100 μL，配制成含各化合物質(zhì)量濃度為2、50、400 ng/mL的質(zhì)控樣品，按“2.4”項下方法處理，在自動進(jìn)樣器中放置8 h后進(jìn)樣分析，每個質(zhì)量濃度平行制備5份，記錄色譜圖。計算各化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算化合物的實測質(zhì)量濃度，計算實測質(zhì)量濃度與配制質(zhì)量濃度的比值，求得樣品在進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性。

2.5.6 基質(zhì)效應(yīng) 取100 μL空白血漿，按“2.4”項下方法處理，制備空白血漿上清液適量，備用。精密移取100 μL質(zhì)量濃度為2、50、400 ng/mL的對照品溶液于1.5 mL離心管中，氮氣吹干，殘渣以100 μL空白血漿上清液復(fù)溶，13 000 r/min離心10 min，取上層清液，進(jìn)行UFLC-MS/MS分析，記錄各化合物峰面積（A）。

精密移取100 μL質(zhì)量濃度為2、50、400 ng/mL的混合對照品溶液于1.5 mL離心管中，氮氣吹干。殘渣以100 μL蒸餾水復(fù)溶，13 000 r/min離心10 min，取上層清液，進(jìn)行UFLC-MS/MS分析，記錄各化合物峰面積（B），計算基質(zhì)效應(yīng)。

基質(zhì)效應(yīng)＝A/B

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用DAS 2.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性試驗 如圖1所示，在該色譜條件下，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、對乙酰氨基酚、連翹苷、沒食子酸、槲皮素的保留時間（tR）分別為3.20、3.21、2.65、3.05、2.17、3.13 min，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾各化合物和內(nèi)標(biāo)的測定。

圖1 空白血漿 (A)、空白血漿加對照品 (B) 以及給藥后血漿樣本 (C) 色譜圖Fig.1 Chromatograms of blank plasma (A), blank plasma plus reference substance (B) and plasma sample after administration (C)

3.1.2 線性范圍和定量限 如表2所示，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿在1～500 ng/mL呈良好的線性關(guān)系，連翹苷、槲皮素在2～500 ng/mL呈良好的線性關(guān)系，沒食子酸在5～500 ng/mL呈良好的線性關(guān)系，表明該方法靈敏度較高，可用于血漿樣品中待測化合物的分析。

表2 血漿樣品中各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、定量限及檢測限Table 2 Standard curve, linear range, quantification limit and detection limit of compounds in plasma samples

3.1.3 準(zhǔn)確度和精密度 如表3所示，高、中、低3個質(zhì)量濃度的待測化合物日內(nèi)精密度與日間精密度RSD均小于15%，準(zhǔn)確度為90.60%～113.50%。

表3 血漿樣品中各化合物的準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度和日間精密度Table 3 Accuracy, intra-day precision and inter-day precision of compounds in plasma samples

3.1.4 穩(wěn)定性 如表4所示，各待測化合物在血漿中于 -20 ℃放置14 d，室溫放置24 h，經(jīng)過3個凍融循環(huán)后基本穩(wěn)定。此外，制備好的樣品在自動進(jìn)樣器中放置8 h基本不影響測定結(jié)果。

表4 血漿樣品中各化合物在不同條件下的穩(wěn)定性Table 4 Stability of compounds in plasma samples under different conditions

3.1.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 如表5所示，高、中、低3個質(zhì)量濃度各待測化合物的提取回收率為73.77%～94.86%，符合生物樣本的分析要求，表明方法提取回收率較高?；|(zhì)效應(yīng)為85.30%～106.17%，表明內(nèi)源性物質(zhì)不干擾各待測化合物的測定。

表5 血漿樣品中各化合物的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)Table 5 Extraction recovery rate and matrix effect of compounds in plasma samples

3.2 藥動學(xué)研究

大鼠給藥第1天，血漿中沒食子酸、槲皮素、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷的血藥濃度-時間曲線如圖2所示，藥動學(xué)參數(shù)見表6。

表6 血漿中沒食子酸、槲皮素、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷的藥動學(xué)參數(shù) (1 d)Table 6 Pharmacokinetic parameters of gallic acid, quercetin, palmatine hydrochloride, berberine hydrochloride and forsythin after administration (1 d)

圖2 血漿中沒食子酸 (A)、槲皮素 (B)、鹽酸巴馬汀 (C)、鹽酸小檗堿 (D)、連翹苷 (E) 的血藥濃度-時間曲線 (1 d)Fig.2 Plasma concentration-time curve of gallic acid (A), quercetin (B), palmatine hydrochloride (C), berberine hydrochloride (D) and forsythin (E) in plasma after administration (1 d)

ig寧泌泰膠囊（0.5 g/kg）第1天，除沒食子酸與連翹苷外，槲皮素、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿在大鼠血漿中的含量均低于定量限；沒食子酸的生物利用度（F）為54.60%，連翹苷的F為16.52%。

ig寧泌泰膠囊（4.0 g/kg）第1天，沒食子酸、槲皮素、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷的半衰期（t1/2）均較短，為0.61～1.87 h，提示各化合物清除較快，不易在體內(nèi)蓄積，各化合物的t1/2由長至短分別為連翹苷（1.87 h）、沒食子酸（1.00 h）、槲皮素（0.94 h）、鹽酸巴馬?。?.92 h）、鹽酸小檗堿（0.61 h）；各化合物的達(dá)峰時間（tmax）為0.28～0.94 h，tmax由高至低排序為沒食子酸＞鹽酸巴馬?。钧}酸小檗堿＞連翹苷＞槲皮素；沒食子酸的達(dá)峰濃度（Cmax）為（240.81±52.95）μg/L，是其余化合物的20～45倍，提示沒食子酸可能在寧泌泰膠囊發(fā)揮藥理活性中較為重要。各化合物的F由高到低分別為沒食子酸21.87%、鹽酸巴馬汀8.32%、連翹苷7.18%、槲皮素4.35%。雖然動物間存在個體差異，但ig寧泌泰膠囊（0.5、4.0 g/kg）后，沒食子酸與連翹苷的血藥濃度-時間曲線行為基本一致。

ig寧泌泰膠囊（0.5、4.0 g/kg）7 d后，沒食子酸、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷和槲皮素的血藥濃度-時間曲線如圖3所示，除鹽酸巴馬汀外，各化合物的血藥濃度-時間曲線行為基本一致。ig寧泌泰膠囊（4.0 g/kg）7 d后，大鼠血漿中的鹽酸巴馬汀的Cmax僅為15 ng/mL。

圖3 沒食子酸、槲皮素、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和連翹苷的血藥濃度-時間曲線 (7 d)Fig.3 Plasma concentration-time curve of gallic acid, quercetin, palmatine hydrochloride, berberine hydrochloride and forsythin after administration on (7 d)

4 討論

本研究建立了快速、靈敏的UFLC-MS/MS方法，用于寧泌泰膠囊中沒食子酸、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷、槲皮素5種成分在大鼠血漿中的藥動學(xué)研究。該方法的專屬性、線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度、回收率和穩(wěn)定性良好，可以用于寧泌泰膠囊體內(nèi)的藥物濃度測定。本研究發(fā)現(xiàn)，寧泌泰膠囊中沒食子酸、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、連翹苷、槲皮素的F高、t1/2短，表明各化合物在體內(nèi)易發(fā)生清除、不易在體內(nèi)蓄積。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突