藁本內(nèi)酯對神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的增殖作用及機(jī)制研究

王 敏 ，Hideki Hayashi，劉建勛，Norio Takagi*，任鈞國

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100091

2.東京藥科大學(xué) 應(yīng)用生化研究室，東京 192-0392

藁本內(nèi)酯為川芎和當(dāng)歸中的內(nèi)酯類化合物[1]，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激[2]、改善學(xué)習(xí)記憶[3]、保護(hù)血腦屏障[4]、保護(hù)神經(jīng)元[5]、抗腫瘤[6]等藥理作用。中醫(yī)理論記載，川芎能夠“上行頭目”，且川芎為臨床治療腦缺血處方中常見配伍藥味之一，藁本內(nèi)酯為川芎揮發(fā)油中含量較大的成分[7-8]。研究顯示，大鼠po藁本內(nèi)酯后，其在腦中的分布較其他組織中多，表明藁本內(nèi)酯具有較好的腦靶向性[9]，在治療腦相關(guān)疾病中具有潛在的優(yōu)勢。

腦缺血后，由于溶栓不及時，癱瘓、偏癱、失語以及學(xué)習(xí)記憶障礙等神經(jīng)損傷癥狀為腦缺血常見的后遺癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命，目前尚無公認(rèn)的針對缺血后神經(jīng)修復(fù)治療的制劑上市。神經(jīng)干/祖細(xì)胞（neural stem/progenitor cells，NS/PCs）的增殖對于腦缺血后神經(jīng)元的修復(fù)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)以及后期神經(jīng)功能的恢復(fù)至關(guān)重要[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)川芎提取物對腦缺血后大鼠體內(nèi)的神經(jīng)祖（母）細(xì)胞具有增殖作用[11]，本研究擬在此基礎(chǔ)上考察川芎中的主要活性成分藁本內(nèi)酯對體外NS/PCs的增殖作用。

1 材料

1.1 動物

孕14 d Wistar大鼠購自日本SLC公司，飼養(yǎng)于（23±1）℃、濕度（55±5）%的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。動物實驗經(jīng)東京藥科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號P20-02）。

1.2 藥品與試劑

藁本內(nèi)酯對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86%，批號111737-201608）購自中國食品藥品檢定研究院；β-actin抗體（批號A5441）、Vimentin抗體購自美國Sigma公司；Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS，批號14175-095）、DMEM/F12培養(yǎng)基（批號11320-033）、B27因子（批號17504-044）購自美國Gibco公司；Accutase細(xì)胞消化液（批號A11105-01）、Alexa Fluor 488標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG抗體（批號A11037）、Alexa Fluor 594標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG抗體（批號A11029）購自美國Invitrogen公司；DNase I（批號LK003170）購自美國Worthington Biochemical公司；100×雙抗（批號168-23191）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF，批號059-07873）、D-PBS（批號045-29795）購自日本W(wǎng)ako公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號166717）、Percoll細(xì)胞分離液（批號17-0891-02）購自美國GE Healthcare公司；神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)添加劑N2 MAX Media Supplement（批號AR009）購自美國RD System公司；成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF，批號031908）購自美國Peprotech公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體（批號4060S）、Akt抗體（批號2920S）、磷酸化糖原合成酶激酶（phosphorylated glycose synthase kinase 3β，p-GSK3β）抗體（批號5558S）、GSK3β抗體（批號9315S）、active-β-catenin抗體（批號8814S）、β3-tubulin抗體（批號5741S）、β-actin抗體購自美國CST公司；WST-1檢測試劑（批號346-06454）、Hoechst細(xì)胞核染料（批號346-07951）購自日本DojinDo公司；HRP標(biāo)記的二抗購自美國Pierce Biotechnology公司。

1.3 儀器

培養(yǎng)瓶（美國Thermo Fisher Scientific公司）；解剖顯微鏡（日本Olympus公司）；6200型離心機(jī)（日本Kobota公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；細(xì)胞過濾器（美國Falcon公司）。

2 方法

2.1 原代大鼠NS/PCs的分離培養(yǎng)

取孕14 d大鼠，脫頸椎處死，腹部以75%乙醇消毒，快速打開腹腔，取出子宮，以預(yù)冷的HBSS溶液清洗2次，轉(zhuǎn)移至含HBSS溶液的無菌培養(yǎng)皿中，再轉(zhuǎn)移至無菌分離操作臺，于解剖顯微鏡下打開子宮，取出胎鼠，剪下胎鼠頭，剝離腦膜，分離雙側(cè)皮層，無菌手術(shù)刀切碎組織（整個操作過程盡量控制在15～20 min完成，以保證較好的細(xì)胞活性）。加入6 mL PBS溶液懸浮組織，轉(zhuǎn)移至離心管中，靜置5 min，棄去上清液；加入2.5 mL含500 μL胰酶、400 μL DNase I的PBS溶液，混勻，于37 ℃水浴中溫育25 min；棄上清，加入5 mL含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，經(jīng)細(xì)胞過濾器（40 μm）濾過，收集濾液；離心，棄上清，加入35% Percoll分離液，將沉淀物轉(zhuǎn)移至離心管中，混合均勻，離心；加入65% Percoll分離液，離心；轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，混勻，離心；棄上清，再加入DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打至肉眼不可見漂浮物，離心；棄上清液，加入N2 plus DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打均勻后，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，分別加入EGF、FGF（20 ng/mL），輕輕混勻，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4 d，更換培養(yǎng)液；培養(yǎng)6～7 d，收集細(xì)胞懸浮液，離心，棄上清液，加入Accutase細(xì)胞分離液消化，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打至肉眼不可見漂浮物，離心；棄上清液，加入N2 plus DMEM/F12培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)后，按照所需細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。

2.2 藁本內(nèi)酯對NS/PCs存活率的影響

NS/PCs以5×104/孔接種于24孔板中，適應(yīng)30 min。設(shè)置對照組和藁本內(nèi)酯（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μmol/L）組，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，按WST-1試劑說明書檢測各組細(xì)胞存活率。

2.3 藁本內(nèi)酯對NS/PCs p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β和active-β-catenin蛋白表達(dá)的影響

NS/PCs以1×106/孔接種于6孔板中，設(shè)置溶劑組和藁本內(nèi)酯（25 μmol/L）組，給藥組加入藥物，溶劑組加入0.006%二甲基亞砜（DMSO），培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，以PBS溶液洗滌，棄去上清液，加入110 μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液（含50 mmol/L Tris-HCL、1 mmol/L EDTA、0.1%脫氧膽酸鈉、1% TritonX-100），于冰水浴中超聲裂解。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，加入上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min使蛋白變性，放置至室溫后，于 -80 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，分別加入p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β、active-β-catenin、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；以TBST溶液洗滌，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶5000），室溫孵育1 h；以TBST溶液洗滌，加入ECL發(fā)光試劑反應(yīng)1 min，于成像系統(tǒng)儀中曝光，使用CS Analyzer 4.Version 2.1.2軟件進(jìn)行定量分析。

2.4 藁本內(nèi)酯對NS/PCs神經(jīng)球直徑的影響

NS/PCs以5×105/孔接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)4 d。設(shè)置溶劑組和藁本內(nèi)酯（25 μmol/L）組，給藥組加入藥物，溶劑組加入0.006% DMSO。分別于給藥后第1、2、3天，于顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取5張照片，使用顯微鏡自帶的軟件測量視野下神經(jīng)球的直徑（直徑＜40 μm不計入）。

2.5 藁本內(nèi)酯對NS/PCs分化類型的影響

NS/PCs原代分離培養(yǎng)7 d，消化后加入分化培養(yǎng)基（含2% B27、0.5% FBS、1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基），調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，以2×104/孔接種于24孔板中（培養(yǎng)板預(yù)先用poly-D-lysine溶液包被），設(shè)置對照組、溶劑組和藁本內(nèi)酯（25 μmol/L）組，給藥組加入100 μL藥物，溶劑組加入等體積0.006% DMSO，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，分化3 d時更換新鮮培養(yǎng)基，分化5 d進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。

以PBS溶液洗滌，棄去洗液，加入4%多聚甲醛，室溫固定10 min；棄去固定液，以PBS溶液洗滌，加入0.2% TritonX-100，室溫透化10 min；棄去上清液，加入封閉液，室溫封閉30 min；棄去封閉液，分別加入β3-tublin抗體（1∶500）、vimentin抗體（1∶2000），4 ℃孵育過夜；以PBS溶液洗滌，加入山羊抗兔或鼠IgG抗體（1∶200）孵育1 h；棄去溶液，加入含細(xì)胞核染料Hoechst33342（1∶2000）的PBS溶液清洗3次，棄去洗液，封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 藁本內(nèi)酯對分化細(xì)胞存活率的影響

NS/PCs以5×104/孔接種于24孔板中，設(shè)置溶劑組和藁本內(nèi)酯（25 μmol/L）組，按“2.5”項下方法處理細(xì)胞，分化3 d時更換新鮮培養(yǎng)基，分化5 d按WST-1試劑說明書檢測各組細(xì)胞存活率。

2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以±s表示，使用SAS 8.2軟件進(jìn)行單因素方差分析，Tukey’s檢驗作事后分析。

3 結(jié)果

3.1 藁本內(nèi)酯對NS/PCs存活率的影響

如圖1所示，與對照組比較，25 μmol/L藁本內(nèi)酯可顯著增加NS/PCs存活率（P＜0.05）。

圖1 藁本內(nèi)酯對NS/PCs存活率的影響 (±s, n = 5)Fig.1 Effect of ligustilide on survival rate of NS/PCs(±s, n = 5)

3.2 藁本內(nèi)酯對NS/PCs p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β和active-β-catenin蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與溶劑組比較，藁本內(nèi)酯可顯著上調(diào)NS/PCs中p-Akt/Akt、active-β-catenin蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），但對p-GSK3β/GSK3β蛋白表達(dá)無明顯影響。

圖2 藁本內(nèi)酯對NS/PCs p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β和active-β-catenin蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 6)Fig.2 Effect of ligustilide on p-Akt, Akt, p-GSK3β, GSK3β and active-β-catenin protein expressions in NS/PCs (±s, n = 6)

3.3 藁本內(nèi)酯對NS/PCs神經(jīng)球直徑的影響

如圖3所示，隨著培養(yǎng)時間的增加，NS/PCs神經(jīng)球直徑逐漸增大；連續(xù)給予藁本內(nèi)酯1～3 d，與溶劑組比較，NS/PCs神經(jīng)球直徑有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖3 藁本內(nèi)酯對NS/PCs神經(jīng)球直徑的影響 (±s, n = 6)Fig.3 Effect of ligustilide on diameter of neurospheres in NS/PCs (±s, n = 6)

3.4 藁本內(nèi)酯對NS/PCs分化類型的影響

以β3-tubulin標(biāo)記神經(jīng)元，vimentin標(biāo)記星型膠質(zhì)細(xì)胞，Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核。如圖4所示，藁本內(nèi)酯對神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化均無顯著影響。

圖4 藁本內(nèi)酯對NS/PCs分化類型的影響 (±s, n = 4)Fig.4 Effect of ligustilide on differentiated type of NS/PCs (±s, n = 4)

3.5 藁本內(nèi)酯對分化細(xì)胞存活率的影響

如圖5所示，與溶劑組比較，藁本內(nèi)酯顯著提高分化細(xì)胞的存活率（P＜0.05）。

圖5 藁本內(nèi)酯對分化細(xì)胞存活率的影響 (±s, n = 8)Fig.5 Effect of ligustilide on survival rate of differentiated cells (±s, n = 8)

4 討論

腦缺血后神經(jīng)元大量死亡，刺激內(nèi)源性的神經(jīng)干細(xì)胞開始分化，但由于缺血后內(nèi)環(huán)境的惡化，導(dǎo)致新生的NS/PCs逐漸死亡，影響后期的分化和神經(jīng)單元的重構(gòu)。因此，維持腦缺血后早期階段NS/PCs的持續(xù)增殖和存活是后期神經(jīng)元和神經(jīng)功能恢復(fù)的基礎(chǔ)[12]。本研究采用課題組前期建立的NS/PCs分離培養(yǎng)方法[13]，獲得生長狀態(tài)良好、較穩(wěn)定的神經(jīng)球，可用于藥物的研究。由于NS/PCs自我更新和多功能的特性，孕鼠狀態(tài)、分離時間、溫度、培養(yǎng)基、操作等細(xì)節(jié)均會影響細(xì)胞懸浮狀態(tài)或生長，因此，嚴(yán)格控制實驗條件，對于獲得狀態(tài)較穩(wěn)定的細(xì)胞至關(guān)重要。

細(xì)胞的增殖和分化是神經(jīng)干細(xì)胞的2個重要特性。本研究首先檢測了藁本內(nèi)酯對NS/PCs增殖的影響，WST-1法為檢測細(xì)胞數(shù)量與活力的方法之一，結(jié)果顯示，25 μmol/L藁本內(nèi)酯可促進(jìn)NS/PCs增殖，且呈非線性關(guān)系。查閱文獻(xiàn)，部分學(xué)者報道，藁本內(nèi)酯在體內(nèi)的藥動學(xué)研究呈非線性[14]，藁本內(nèi)酯對缺氧缺糖神經(jīng)細(xì)胞PC12具有雙向調(diào)節(jié)作用[15]，提示對藁本內(nèi)酯進(jìn)行研究時，應(yīng)關(guān)注劑量對藥理作用的影響。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-Akt為神經(jīng)干細(xì)胞增殖、存活、分化、遷移中的重要通路[16-17]，Akt、p-GSK3β、activeβ-catenin為PI3K介導(dǎo)的通路中的關(guān)鍵蛋白[18]，Akt可直接激活β-catenin或通過GSK3β間接激活β-catenin[19]。正常狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin與GSK3β、APC等形成蛋白復(fù)合體，磷酸化后最終通過泛素化-蛋白酶系統(tǒng)降解；而非磷酸化的β-catenin則轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與細(xì)胞的增殖、分化等[20-21]。本研究結(jié)果顯示，藁本內(nèi)酯可通過激活PI3K-Akt/β-catenin通路促進(jìn)NS/PCs增殖。

神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞是NS/PCs主要的2種分化類型，vimentin為星形膠質(zhì)細(xì)胞早期標(biāo)志物，β3-tubulin為神經(jīng)元早期標(biāo)志物[22]。結(jié)果顯示，藁本內(nèi)酯對星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞分化均無顯著影響，但分化細(xì)胞活力卻有所提高；鏡下觀察，未被vimentin或β3-tubulin標(biāo)記的細(xì)胞有所增加，推測藁本內(nèi)酯可能促進(jìn)其他類型細(xì)胞的分化（圖6）。

圖6 藁本內(nèi)酯對NS/PCs可能的作用機(jī)制Fig.6 Proposed mechanisms of ligustilide on NS/PCs

以往對藁本內(nèi)酯治療腦缺血損傷的研究主要集中于改善血流或神經(jīng)保護(hù)，對促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)研究較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，川芎提取物對腦缺血后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)母細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。因藁本內(nèi)酯為川芎中含量較大的成分之一，并且體外篩選其表現(xiàn)出較好的神經(jīng)藥理活性，故選擇藁本內(nèi)酯這一研究對象，從促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖這一新的角度，闡釋了藁本內(nèi)酯通過激活A(yù)kt/β-catenin通路促進(jìn)NS/PCs增殖，提示藁本內(nèi)酯為神經(jīng)修復(fù)治療研究的潛在藥物之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突