人參皂苷Re對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)離體灌流大鼠心臟心律失常的調(diào)節(jié)作用

曹瑀瑩，杜丙秀，李劭恒，袁 碩, ，陶雅軍，劉麗萍*，陳穎卿*

1.大連大學(xué) 慢性病研究中心大連市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116622

2.延邊大學(xué)，吉林 延吉 133022

心律失常指心律起源部位、心搏頻率與節(jié)律以及沖動(dòng)傳導(dǎo)等任一項(xiàng)異常，是心血管疾病中的常見(jiàn)病和多發(fā)病。目前我國(guó)心血管病患病人數(shù)達(dá)2.9億，而心律失?；颊呒s有2000萬(wàn)人。因此，防治心律失常十分重要。臨床上心律失常按照心率的快慢可分為快速型和緩慢型心律失常，其中快速型心律失常的發(fā)病率、嚴(yán)重性、治療難度遠(yuǎn)大于緩慢型心律失常。人參是百草之王，用于治療心血管疾病已有2000多年的歷史。人參皂苷是人參中主要的活性成分，其中人參皂苷Re是最關(guān)鍵的生物活性成分[1]。人參皂苷Re對(duì)心血管系統(tǒng)具有較好的保護(hù)作用，如改善心肌重構(gòu)和纖維化[2-4]、緩解心肌缺血再灌注損傷[5-6]、減輕心肌損傷[7]、抗心律失常[8-12]、促進(jìn)血管再生[13]。

G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)傳遞通路是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的重要途徑，G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）是人體內(nèi)最大的膜蛋白受體家族，目前72.9%心血管疾病藥物以GPCR為靶點(diǎn)[14-15]。β-腎上腺素能受體（β-adrenergic receptor，β-AR）屬于細(xì)胞膜上GPCR超家族，在心臟生理活動(dòng)中起著重要的作用。當(dāng)異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）刺激β-AR時(shí)，可以上調(diào)GPCR，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶（adenylyl cyclase，AC），使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）升高，進(jìn)一步激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），引起鈣通道蛋白的磷酸化，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，從而引起心律失常[11]。

炎性因子作為炎性反應(yīng)中活化細(xì)胞產(chǎn)生的具有高活性、多功能的可溶性肽，可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控心血管功能。趨化因子是一組具有特定吸引功能的細(xì)胞因子，迄今發(fā)現(xiàn)的52個(gè)趨化因子中，19個(gè)趨化因子與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌肥大、心衰、冠狀動(dòng)脈疾病等心臟疾病相關(guān)[16]。趨化因子也參與損傷反應(yīng)的早晚期，并與心律失常和心臟移植的慢性排斥反應(yīng)密切相關(guān)[17]。在心肌細(xì)胞中，炎性因子釋放引起的炎性反應(yīng)會(huì)造成心肌細(xì)胞損傷，當(dāng)產(chǎn)生心肌損傷后，往往會(huì)導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。此外，炎性反應(yīng)也可以導(dǎo)致心肌傳導(dǎo)的不均一性，易引起心室重構(gòu)和室性心律失常的發(fā)生[18]。

本研究通過(guò)構(gòu)建ISO誘導(dǎo)的大鼠快速型心律失常模型，觀察人參皂苷Re的抗心律失常作用，并探討人參皂苷Re緩解快速型心律失常的潛在作用機(jī)制，為臨床開(kāi)發(fā)低毒高效的抗心律失常藥物提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠（10～12周齡，體質(zhì)量280～320 g）以及Wistar新生乳鼠（≤3 d）均購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水，溫度（23±1）℃，相對(duì)濕度50%～70%，光/暗周期12 h，環(huán)境噪聲低于50分貝。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)202004038）

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Re（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)wkq16081605）購(gòu)自四川省維克齊生物科技有限公司；鹽酸ISO（批號(hào)BCBL3022V）、NaCl（批號(hào)BCBV3784V）、KCl（批號(hào)BCBQ0895V）、MgSO4·7H2O（批號(hào)BCBJ7824V）、NaH2PO4（批號(hào)BCBM7996V）、NaHCO3（批號(hào)SLBZ5815）、HEPES（批號(hào)SLBL5403V）、CaCl2（批號(hào)I1020）、MgCl2（批號(hào)H0950）、葡萄糖（批號(hào)071M0145V）、胰酶（批號(hào) SLBM4075V）和谷氨酰胺（批號(hào)RNBD5611V）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鹽酸普萘洛爾（批號(hào)26496）購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；膠原酶A（批號(hào)33278522）購(gòu)自瑞士Roche公司；水合氯醛（批號(hào)20190801）購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)811723）、雙抗（批號(hào)2029632）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（批號(hào)1719426）購(gòu)自以色列BI公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)06/2019）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)08/2019）購(gòu)自上海語(yǔ)純生物技術(shù)有限公司；趨化因子1（C-X-C motif chemokine 1，CXCL1）ELISA試劑盒（批號(hào)J21032177）、CXCL2 ELISA試劑盒（批號(hào)I11031020）、CXCL3 ELISA試劑盒（批號(hào)K1802176）購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 儀器

EMS64-USB-1002型多電極陣列映射系統(tǒng)（英國(guó)MappingLab公司）；NIUSB-6001型熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（英國(guó)CAIRN公司）；SpectraMax Plus 384型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）。

2 方法

2.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

新生Wistar乳鼠處死后立即取出心臟，放置于預(yù)冷的臺(tái)式液（135 mmol/L NaCl、4.5 mmol/L KCl、20 mmol/L HEPES、11 mmol/L葡萄糖、1 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2）中洗去血液，將心室肌剪成1 mm3小塊，移至含5 mL膠原酶A（0.45 mg/mL）的臺(tái)式液中，于37 ℃輕輕攪拌消化15 min，棄上清，重復(fù)2次。加入含5 mL胰酶（1.25 mg/mL）的臺(tái)式液，于37 ℃輕輕攪拌消化5 min，收集上清于1 mL胎牛血清中，800 r/min離心5 min，棄上清；胰酶重復(fù)消化4～5次，直至所有組織消化，收集全部細(xì)胞液，800 r/min離心5 min，用原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)液（84.5% DMEM培養(yǎng)基、15%胎牛血清、1%谷氨酰胺、0.1%雙抗）重懸細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2 h后收集上清，離心后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

2.2 CCK-8檢測(cè)人參皂苷Re對(duì)原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響

取分離好的原代乳鼠心肌細(xì)胞，以1×106/mL接種于96孔板中，100 μL/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組和人參皂苷Re（1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μmol/L）組，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8，于37 ℃孵育3 h，采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝A給藥/A對(duì)照

2.3 離體心臟Langendorff灌流

根據(jù)課題組前期研究結(jié)果[3]，將人參皂苷Re濃度定為5 μmol/L。Wistar大鼠ip 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù)，取出心臟立即放入含肝素（10 mg/L）和飽和氣體（95% O2、5% CO2）的冰冷Krebs-Henseleit緩沖液（120.3 mmol/L NaCl、4 mmol/L KCl、1.3 mmol/L MgSO4·7H2O、1.2 mmol/L NaH2PO4、1.2 mmol/L CaCl2、25.2 mmol/L NaHCO3、11 mmol/L葡萄糖）中，快速摘除結(jié)締組織和肺組織，留下3～4 mm主動(dòng)脈，將主動(dòng)脈插管并連接到Langendorff灌流系統(tǒng)上，以7 mL/min速度主動(dòng)脈逆行灌流正常緩沖液或工具藥。灌流液全程37 ℃恒溫、持續(xù)供氧。實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)圖1。

圖1 離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)方案Fig.1 Experimental protocol of isolated heart perfusion

對(duì)照組灌流4個(gè)循環(huán)緩沖液；ISO組經(jīng)過(guò)3個(gè)對(duì)照循環(huán)，灌流1個(gè)循環(huán)ISO（0.5 μmol/L）；人參皂苷Re＋I(xiàn)SO組經(jīng)過(guò)2個(gè)對(duì)照循環(huán)，預(yù)灌流1個(gè)循環(huán)人參皂苷Re（5 μmol/L），然后在人參皂苷Re存在下，灌流1個(gè)循環(huán)ISO（0.5 μmol/L）；非選擇性β-AR抑制劑普萘洛爾組經(jīng)過(guò)2個(gè)對(duì)照循環(huán)，預(yù)灌流普萘洛爾（1 μmol/L）1個(gè)循環(huán)，然后在普萘洛爾存在下，灌流1個(gè)循環(huán)ISO（0.5 μmol/L）；人參皂苷Re組經(jīng)過(guò)1個(gè)對(duì)照循環(huán)，分別灌流人參皂苷Re（1、5、10 μmol/L）各1個(gè)循環(huán)。

2.4 多電極陣列映射系統(tǒng)檢測(cè)人參皂苷Re對(duì)ISO所致心律失常大鼠左右心室肌心外膜電生理指標(biāo)的影響

離體心臟固定到Langendorff灌流裝置上，2個(gè)多通道電極分別貼附右心室和左心室游離壁，并連至多電極陣列映射系統(tǒng)上，對(duì)心臟電位進(jìn)行多點(diǎn)同步標(biāo)測(cè)。每5分鐘設(shè)為1個(gè)實(shí)驗(yàn)循環(huán)，待各組大鼠心臟搏動(dòng)穩(wěn)定20 min后，開(kāi)始記錄心率、動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度和傳導(dǎo)方向等指標(biāo)。每個(gè)多電極陣列（MEA PA03206060203）由32個(gè)直徑為0.1 mm的電極組成，在6×6網(wǎng)格（尺寸為6 mm×6 mm）中，電極間距為1.2 mm。64個(gè)記錄電極連接到64通道放大器和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。每個(gè)通道的采樣頻率設(shè)置為10 kHz，場(chǎng)電位記錄與放置在心臟灌注金屬套管上的參比電極的場(chǎng)電位記錄相對(duì)應(yīng)，MEA使用EMapScope軟件提供了細(xì)胞外場(chǎng)電位的無(wú)創(chuàng)同步64通道記錄。EMapScope軟件允許實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所有64個(gè)通道的場(chǎng)電位，以此為基礎(chǔ)計(jì)算心率；根據(jù)記錄陣列中第1個(gè)檢測(cè)到的波形的相對(duì)延遲計(jì)算每個(gè)通道的激活時(shí)間。為了生成心外膜傳播圖，在顯示原始記錄陣列布局的6×6網(wǎng)格中，用色標(biāo)表示每個(gè)通道的激活時(shí)間，生成心外膜傳播圖，以便更清晰地查看傳導(dǎo)模式和傳導(dǎo)方向。

2.5 蘇木素-伊紅（HE）染色檢測(cè)心肌組織損傷

ISO組、ISO＋人參皂苷Re組以及普萘洛爾＋I(xiàn)SO組離體心臟的灌流持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)至2個(gè)循環(huán)，以便明顯觀測(cè)其心肌組織損傷程度。取Langendorff灌流大鼠心臟放入4%多聚甲醛固定液中，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片后進(jìn)行脫蠟水化，通過(guò)蘇木素染色、分化液分化、伊紅染色后，脫水、透明、封片，根據(jù)脂肪變性程度評(píng)價(jià)人參皂苷Re對(duì)ISO誘導(dǎo)的離體大鼠心肌組織病理變化的保護(hù)程度。

2.6 人參皂苷Re對(duì)ISO誘導(dǎo)原代乳鼠心肌細(xì)胞cAMP和PKA含量的影響

將原代乳鼠心肌細(xì)胞以3×105/孔接種于6孔板內(nèi)的載玻片上，轉(zhuǎn)染cAMP或PKA熒光探針（Epac-SH187或AKAR4），12 h后，將載玻片移入熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像系統(tǒng)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）。采用FRET動(dòng)態(tài)觀察cAMP和PKA含量變化。通過(guò)激發(fā)青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein，CFP）480 nm后，計(jì)算CFP與黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）熒光發(fā)射強(qiáng)度比值（480 nm/535 nm）的變化實(shí)時(shí)觀察cAMP含量；通過(guò)計(jì)算YFP與CFP熒光發(fā)射強(qiáng)度比值（535 nm/480 nm）的變化實(shí)時(shí)觀察PKA含量。實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)圖2。

圖2 原代乳鼠心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案Fig.2 Experimental protocol of primary neonatal rat cardiomyocytes

2.6.1 ISO不同濃度組 基線平穩(wěn)后，記錄2 min細(xì)胞正常狀態(tài)后，每4分鐘分別給予ISO（0.1、1.0、5.0 nmol/L）、25 μmol/L腺苷酸環(huán)化酶激活劑（Forskolin）和100 μmol/L磷酸二酯酶抑制劑（IBMX）。Forskolin激活腺苷酸環(huán)化酶，進(jìn)而激活cAMP，IBMX抑制cAMP降解，二者共同作用使心肌細(xì)胞cAMP含量達(dá)到飽和。

2.6.2 人參皂苷Re＋I(xiàn)SO組 細(xì)胞預(yù)先孵育人參皂苷Re 20 min后，再給予不同濃度ISO和Forskolin（25 μmol/L）＋I(xiàn)BMX（100 μmol/L）。

2.6.3 人參皂苷Re組 基線平穩(wěn)后，記錄2 min細(xì)胞正常狀態(tài)后，每4分鐘分別給予人參皂苷Re（5、10 μmol/L）、Forskolin（25 μmol/L）和IBMX（100 μmol/L）。

實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA含量變化，明確ISO所致心律失常傳導(dǎo)通路及人參皂苷Re的干預(yù)作用。

2.7 高通量基因測(cè)序與生物信息分析

Langendorff灌流結(jié)束后立即取下心臟，剪取心尖部位放置RNA保護(hù)液中，寄至上海華大基因科技有限公司，將對(duì)照組和ISO組大鼠心室肌進(jìn)行高通量基因測(cè)序和生物信息分析，以檢測(cè)心律失常模型組的可能致病基因。

2.8 ELISA法檢測(cè)心肌組織炎性因子水平

取Langendorff灌流后的離體心臟，于冰上剪碎、勻漿，取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組離體心臟組織上清液CXCL1、CXCL2、CXCL3、TNF-α和IL-6水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Prism（6.0版）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析并進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Re對(duì)原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響

如圖3所示，人參皂苷Re（1～50 μmol/L）對(duì)原代乳鼠心肌細(xì)胞的存活率無(wú)影響。

圖3 人參皂苷Re對(duì)原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響(±s, n = 5)Fig.3 Effect of ginsenoside Re on survival rate of primary neonatal rat cardiomyocytes (±s, n = 5)

3.2 人參皂苷Re對(duì)ISO所致心律失常大鼠心室肌傳導(dǎo)方向、傳導(dǎo)速度及心率的影響

多電極陣列映射系統(tǒng)筆試電極分別貼附左右心室心外膜表面（圖4-A），2個(gè)32通道電極在左右心室上對(duì)應(yīng)位置，在1次心跳中，每個(gè)通道都會(huì)得到1個(gè)激活時(shí)間。根據(jù)各個(gè)通道在1次心跳的激活時(shí)間順序進(jìn)行色彩分級(jí)，箭頭所指方向可見(jiàn)深紅色代表最早激活，深藍(lán)色代表最晚激活，將比例圖轉(zhuǎn)換成等時(shí)圖，更加凸顯傳導(dǎo)模式和方向以及傳導(dǎo)過(guò)程中的任何心律失常情況（圖4-B）。

如圖4-C所示，與對(duì)照組比較，ISO組大鼠心率顯著增加（P＜0.05）；與ISO組比較，人參皂苷Re＋I(xiàn)SO組大鼠心率明顯降低（P＜0.05）。如圖4-D所示，與對(duì)照組比較，ISO組左心室傳導(dǎo)速度明顯增加，傳導(dǎo)方向紊亂。如圖4-E所示，與對(duì)照組比較，人參皂苷Re（5 μmol/L）預(yù)處理5 min，左右心室傳導(dǎo)方向沒(méi)有改變，左心室傳導(dǎo)速度略微減慢，但不明顯；在人參皂苷Re存在下，灌流ISO 5 min，傳導(dǎo)方向和傳導(dǎo)速度均未見(jiàn)明顯變化。如圖4-F所示，與對(duì)照組比較，普萘洛爾（1 μmol/L）預(yù)處理5 min，左右心室傳導(dǎo)方向沒(méi)有改變，左心室傳導(dǎo)速度略微增加；在普萘洛爾存在下，灌流ISO 5 min，傳導(dǎo)方向未見(jiàn)明顯改變，左心室傳導(dǎo)速度略有加快。如圖4-G所示，灌流不同濃度的人參皂苷Re（1、5、10 μmol/L）后，左右心室的傳導(dǎo)速度和傳導(dǎo)方向均未見(jiàn)明顯變化。以上結(jié)果表明，人參皂苷Re顯著下調(diào)ISO所致的心率增加，明顯抑制ISO所致心律失常大鼠心室肌傳導(dǎo)方向、傳導(dǎo)速度的改變。人參皂苷Re對(duì)ISO所致離體大鼠心室肌快速型心律失常具有明顯的抑制作用。

圖4 人參皂苷Re改善快速型心律失常的心肌電活動(dòng)Fig.4 Ginsenoside Re improves myocardial electrical activity in tachyarrhythmia

3.3 人參皂苷Re對(duì)ISO所致心律失常離體大鼠心肌損傷的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，ISO組大鼠心肌細(xì)胞脂肪變性嚴(yán)重程度增加；人參皂苷Re（5 μmol/L）預(yù)處理5 min后，再給予ISO＋人參皂苷Re處理10 min時(shí)，心肌細(xì)胞脂肪變性嚴(yán)重程度降低；普萘洛爾（1 μmol/L）預(yù)處理5 min再給予ISO＋普萘洛爾處理10 min時(shí)，心肌損傷也得到了緩解。表明人參皂苷Re能夠明顯減輕ISO誘導(dǎo)的離體灌流大鼠心肌損傷。

圖5 人參皂苷Re對(duì)ISO所致心律失常離體大鼠心肌損傷的影響 (HE, ×400)Fig.5 Effect of ginsenoside Re on myocardial injury in isolated cardiomyocytes of rats with arrhythmia induced by ISO (HE, × 400)

3.4 人參皂苷Re對(duì)ISO誘導(dǎo)原代乳鼠心肌細(xì)胞cAMP/PKA通路及其細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

3.4.1 人參皂苷Re對(duì)ISO所致原代乳鼠心肌細(xì)胞cAMP和PKA含量變化的影響 不同濃度ISO（0.1、1.0、5.0、10.0 nmol/L）對(duì)FRET cAMP熒光團(tuán)標(biāo)記物YFP和CFP熒光強(qiáng)度變化見(jiàn)圖6-A，cAMP含量用CFP與YFP比值（480 nm/535 nm）表示，心肌細(xì)胞顏色變化代表不同時(shí)間段細(xì)胞內(nèi)cAMP含量變化（圖6-B）。待心肌細(xì)胞穩(wěn)定后，分別孵育人參皂苷Re（5、10 μmol/L）各4 min，隨后加入Forskolin、IBMX孵育2 min，使心肌細(xì)胞cAMP含量達(dá)到飽和。如圖6-C所示，不同濃度人參皂苷Re對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP含量無(wú)影響。以人參皂苷Re（5 μmol/L）預(yù)處理心肌細(xì)胞20 min，再以不同濃度的ISO（0.1、1.0、5.0 nmol/L）各處理4 min，如圖6-D～G所示，與單獨(dú)給予不同濃度ISO處理比較，人參皂苷Re顯著降低不同濃度ISO所致乳鼠心肌細(xì)胞cAMP和PKA含量。表明人參皂苷Re能夠通過(guò)抑制cAMP/PKA通路緩解ISO所致快速型心律失常的發(fā)生。

圖6 人參皂苷Re對(duì)ISO所致原代乳鼠心肌細(xì)胞cAMP和PKA含量變化的影響Fig.6 Effect of ginsenoside Re on content change of cAMP and PKA in primary neonatal rat cardiomyocytes induced by ISO

3.4.2 原代乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP和PKA含量改變時(shí)的熒光及細(xì)胞形態(tài)變化 心肌細(xì)胞顏色變化代表不同時(shí)間段細(xì)胞內(nèi)cAMP含量變化，細(xì)胞顏色越綠表示cAMP含量越高，顏色越藍(lán)表示PKA含量越高。如圖7-A所示，不同濃度的人參皂苷Re對(duì)原代乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯改變。如圖7-B所示，當(dāng)給予不同濃度ISO時(shí)，隨著ISO濃度的增加，原代乳鼠心肌細(xì)胞顏色越綠，表明其cAMP含量不斷增加，在ISO濃度為1 nmol/L時(shí)cAMP含量基本達(dá)到飽和。如圖7-D所示，隨著ISO濃度的增加心肌細(xì)胞顏色愈發(fā)變藍(lán)，表明其PKA含量不斷增加。如圖7-C、E所示，當(dāng)給予人參皂苷Re（5 μmol/L）預(yù)處理后，心肌細(xì)胞的顏色變化明顯減小。由于藥物處理時(shí)間較短，細(xì)胞未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)變化。

圖7 人參皂苷Re抑制ISO所致的原代乳鼠心肌細(xì)胞中cAMP (A、B、C) 和PKA (D、E) 含量增加時(shí)的細(xì)胞變化 (×1000)Fig.7 Cellular changes with increase of cAMP (A, B, C) and PKA (D, E) content in ISO-induced primary neonatal rat cardiomyocytes inhibited by ginsenoside Re (× 1000)

3.5 人參皂苷Re對(duì)ISO所致離體灌流大鼠心室肌炎性因子水平的影響

為了找到對(duì)照組和模型組的差異基因，從而鎖定藥物治療靶標(biāo)，本研究對(duì)對(duì)照組和ISO組大鼠心室肌進(jìn)行高通量基因測(cè)序及生物信息分析，發(fā)現(xiàn)與炎性反應(yīng)相關(guān)35個(gè)基因、趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路12個(gè)基因、細(xì)胞因子24個(gè)基因、趨化因子11個(gè)基因在ISO組中高表達(dá)（圖8-A）。隨后對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，如圖8-B所示，與對(duì)照組比較，ISO組大鼠心室肌CXCL1、CXCL2、CXCL3、TNF-α和IL-6水平均顯著增加（P＜0.05）；與ISO組比較，人參皂苷Re＋I(xiàn)SO組大鼠心室肌CXCL1、CXCL2、CXCL3、TNF-α和IL-6水平均顯著降低（P＜0.05）。表明人參皂苷Re能夠通過(guò)降低ISO所致部分趨化因子和細(xì)胞因子的上調(diào)抑制心律失常。

圖8 基因差異生物信息學(xué)分析 (A) 以及人參皂苷Re抑制ISO所致離體灌流大鼠心室肌炎性因子水平 (B)Fig.8 Genetic difference bioinformatics analysis (A) and ginsenoside Re inhibits levels of inflammatory factors in isolated rat ventricular muscles induced by ISO (B)

4 討論

心律失常是心血管系統(tǒng)最常見(jiàn)病癥之一，可突然發(fā)作而致猝死，亦可持續(xù)累及心臟而致其衰竭。近年來(lái)，抗心律失常化學(xué)藥在臨床應(yīng)用的安全性不斷受到質(zhì)疑，很多藥物本身存在局限性及不良反應(yīng)，且有致心律失常作用[19]，因此，從藥用植物中尋找高效低毒的化合物用于心律失常的防治受到各國(guó)學(xué)者的高度重視[20]。

既往研究表明，人參皂苷Re對(duì)心律失常起著重要的調(diào)節(jié)作用[21]。陳彩霞等[10-11]在ISO誘導(dǎo)的兔心律失常模型中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Re治療后血流動(dòng)力學(xué)各指標(biāo)與模型組同時(shí)段相比，均有顯著性下降，人參皂苷Re能夠使ISO所致的家兔室性心律失常轉(zhuǎn)為竇性心律，且人參皂苷Re的劑量越大，維持竇性節(jié)律的時(shí)間越長(zhǎng)。該研究認(rèn)為，人參皂苷Re可能通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)共同作用，而且各機(jī)制之間相互促進(jìn)、相互關(guān)聯(lián)：①人參皂苷Re是鈣離子拮抗劑，Ca2+內(nèi)流增多會(huì)引發(fā)心律失常；②人參皂苷Re對(duì)KATP通道的開(kāi)放具有調(diào)節(jié)作用；③人參皂苷Re具有清除氧自由基、增加一氧化氮的產(chǎn)生以及膜穩(wěn)定劑等作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Re能夠抑制心室肌細(xì)胞電壓依賴(lài)性的鈉通道、瞬時(shí)外向鉀通道、內(nèi)向整流鉀通道電流和L型鈣通道電流，從而發(fā)揮抗心律失常的作用[22-23]。以上對(duì)人參皂苷Re抑制心律失常的機(jī)制研究主要集中在離子通道方面，對(duì)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究甚少，cAMP/PKA信號(hào)通路和炎性反應(yīng)在人參皂苷Re調(diào)節(jié)心律失常的研究中未見(jiàn)具體報(bào)道。本研究采用多電極陣列映射系統(tǒng)和FRET技術(shù)，實(shí)時(shí)觀察人參皂苷Re對(duì)ISO誘導(dǎo)離體灌流大鼠快速型心律失常的影響并探討其作用機(jī)制。以往研究認(rèn)為人參皂苷Re抑制心律失?？赡苁峭ㄟ^(guò)多個(gè)離子通道共同作用，本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re抑制心律失常具有多靶點(diǎn)作用，人參皂苷Re通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP/PKA通路和抑制炎性反應(yīng)干預(yù)快速型心律失常的發(fā)生。

ISO是非選擇性β1、β2受體激動(dòng)劑，若β受體過(guò)度激活，可通過(guò)上調(diào)GPCR激活下游AC/cAMP/PKA通路，PKA生成過(guò)多，最終導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度瞬間升高。當(dāng)胞內(nèi)游離鈣瞬間增多，可直接延長(zhǎng)復(fù)極，最終導(dǎo)致快速型心律失常的發(fā)生[24]。本研究通過(guò)多電極陣列映射系統(tǒng)觀察離體Langendorff灌流心臟發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Re抑制ISO所致大鼠心室肌傳導(dǎo)速度、傳導(dǎo)方向及心率的改變，抑制ISO誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP和PKA含量的增加。表明人參皂苷Re通過(guò)阻斷ISO與心肌細(xì)胞膜上的GPCR的結(jié)合，抑制其下游cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)通路緩解心律失常（圖9）。

圖9 人參皂苷Re通過(guò)抑制cAMP/PKA信號(hào)通路及炎性因子表達(dá)干預(yù)快速型心律失常Fig.9 Ginsenoside Re interferes with tachyarrhythmia by inhibiting cAMP/PKA signaling pathway and expressions of inflammatory factors

炎性反應(yīng)與室性心律失常密切相關(guān)[25]，炎性反應(yīng)可以導(dǎo)致心肌傳導(dǎo)的不均一性，促進(jìn)心室重構(gòu)和室性心律失常的發(fā)生[18]。心律失?；颊哐逯醒仔砸蜃覶NF-α和IL-6水平顯著增高，經(jīng)人參配伍方劑參麥注射液治療后炎性因子水平明顯降低[26]，炎癥因子表達(dá)較高的患者發(fā)生室性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)也更高[27-28]。在缺血性心力衰竭的模型中，絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活可以誘導(dǎo)CXCL1、TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、纖維化，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)和室性心律失常的發(fā)生[29-30]。在心肌纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCL2和CXCL3表達(dá)均明顯上調(diào)[31]。cAMP/PKA及其下游cAMP反應(yīng)元件（cAMP responsive element binding protein，CREB）的激活是CXCL1基因轉(zhuǎn)錄的主要途徑，而IL-1β也可通過(guò)CREB途徑誘導(dǎo)趨化因子的基因表達(dá)[32]。由此可以推斷，cAMP/PKA通路可能參與調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而引起心肌損傷和心肌纖維化，最終導(dǎo)致心律失常。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Re可以通過(guò)抑制心臟組織中的CXCL1、CXCL2、CXCL3、TNF-α和IL-6水平，發(fā)揮抗心律失常作用（圖9）。

綜上，人參皂苷Re通過(guò)阻斷ISO與心肌細(xì)胞膜上的GPCR結(jié)合，抑制其下游cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)通路和炎性因子水平緩解心律失常。本研究?jī)H在離體組織和心肌細(xì)胞水平對(duì)人參皂苷Re的抗心律失常進(jìn)行分析，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)正進(jìn)一步展開(kāi)，炎性因子抗心律失常的具體機(jī)制有待深入探討。本研究旨在為開(kāi)發(fā)高效低毒的抗快速型心律失常藥物提供科學(xué)依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突