跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)攻擊行為大鼠內(nèi)側(cè)下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)5-HT1A受體、5-HT2A受體蛋白表達(dá)的影響*

張換鴿， 胡柏平

(1. 重慶市體育科學(xué)研究所， 國(guó)家體育總局體質(zhì)評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)機(jī)能監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 401331； 2. 陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，西安 710062)

攻擊是一種應(yīng)激性反應(yīng)，表現(xiàn)在機(jī)體外在的行為變化、情緒變化和機(jī)體內(nèi)部的生理變化，當(dāng)機(jī)體對(duì)應(yīng)激性反應(yīng)不適應(yīng)時(shí)，會(huì)做出異常的行為反應(yīng)。攻擊對(duì)于獲取和保護(hù)領(lǐng)土、食物、伴侶和后代至關(guān)重要，重復(fù)的攻擊性經(jīng)驗(yàn)可能會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)迫性的病理性攻擊，一些精神分裂癥、反社會(huì)人格障礙、沖動(dòng)控制障礙等精神障礙患者，由于對(duì)他人施加暴力行為等攻擊行為，給社會(huì)帶來(lái)較大的危險(xiǎn)性[1]。攻擊行為的升級(jí)和異常是多種精神病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的共同特征，但是目前尚沒(méi)有對(duì)其有效的治療方法。

運(yùn)動(dòng)對(duì)于不良情緒及各種慢性疾病的改善有良好的效果，適宜的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)攻擊模型大鼠的焦慮、緊張情緒和動(dòng)作行為有明顯緩解和改善作用[2]，5-HT是腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，一次性力竭運(yùn)動(dòng)中，大鼠紋狀體細(xì)胞外液中5-HT、5-HTAA水平在運(yùn)動(dòng)后期、力竭和恢復(fù)期顯著增高，運(yùn)動(dòng)疲勞過(guò)程中5-HT的代謝水平顯著增強(qiáng)[3]，也有研究發(fā)現(xiàn)，游泳運(yùn)動(dòng)可以使攻擊行為大鼠海馬神經(jīng)元5-HT1A受體表達(dá)增加，增強(qiáng)5-HT能系統(tǒng)功能，從而減緩了攻擊行為與情緒[4]，但總體上運(yùn)動(dòng)對(duì)于攻擊行為改善及其相關(guān)神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究相對(duì)較少。5-HT一直被認(rèn)為是控制攻擊行為神經(jīng)回路中的關(guān)鍵遞質(zhì)，5-HT受體，5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，合成酶和代謝酶的調(diào)節(jié)受損均與攻擊行為有關(guān)。已有研究表明，在多種5-HT受體亞型中，主要是受體的前兩個(gè)家族5-HT1和5-HT2受體在攻擊行為中具有重要作用[5]。5-HT1A受體是5-羥色胺能系統(tǒng)神經(jīng)傳遞的重要調(diào)節(jié)因素，中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)或內(nèi)側(cè)下丘腦中的5-HT1A受體激活，通過(guò)結(jié)合釋放到腦干神經(jīng)元的5-HT抑制防御性攻擊行為。5-HT從腦干傳遞到中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)、下丘腦及邊緣系統(tǒng)來(lái)影響防御性攻擊行為。當(dāng)前對(duì)5-HT2A 受體多態(tài)性與抗精神病藥反應(yīng)相關(guān)性的研究很多，但結(jié)果不太一致。本研究建立大鼠攻擊模型，采用跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)攻擊行為大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，探討跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)攻擊行為大鼠內(nèi)側(cè)下丘腦(MH)和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(PAG)5-HT1A受體、5-HT2A受體蛋白表達(dá)的影響，為跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)攻擊行為改善的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的探討提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：大鼠跑臺(tái)(杭州段氏制作 DSTP-202)，切片機(jī)(LEICA RM2126)，生物組織攤片烤片機(jī)(YT-6C)，SX51奧林巴斯光學(xué)顯微鏡。

主要試劑：Anti-5-HTR1A(bs-1124R)，Anti-5-HTR2A(bs-1124R)，均購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素試劑盒(SP-0023)，又稱(chēng)免疫組化染色試劑盒，購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(AR1021)，購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及攻擊模型建立

3月齡雄性SD大鼠40只，體重160 ～ 180 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[ SCXK(陜)2012-003 ]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，環(huán)境溫度(24±2)℃，濕度45%～55%，自然晝夜節(jié)律。

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為4組：安靜對(duì)照組(A)、攻擊模型組(G)、攻擊跑臺(tái)組(GP)、入侵組(R)，每組10只。A組和R組分別群居飼養(yǎng)，其中R組在建造攻擊模型時(shí)作為外來(lái)入侵鼠，從開(kāi)始造模到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，入侵G組和GP組誘導(dǎo)攻擊行為發(fā)生，在結(jié)果中不作處理。G組和GP組單籠飼養(yǎng)一周后，適應(yīng)環(huán)境，形成領(lǐng)地意識(shí)，采用單籠飼養(yǎng)+入侵鼠入侵建造攻擊模型，每天18：30～22：30之間加入入侵鼠，觀察攻擊鼠行為變化，建模成功的特征是大鼠背部拱起、耳朵縮回、豎毛、沖動(dòng)、攀壓以及用前爪撞擊對(duì)方[6]。造模成功后，入侵組每天繼續(xù)對(duì)G組和GP組進(jìn)行攻擊行為誘導(dǎo)，同時(shí)，對(duì)GP組進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

1.3 運(yùn)動(dòng)干預(yù)

參考Bedford等[7]的研究制定運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案，跑臺(tái)訓(xùn)練的第一周為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練適應(yīng)周，采用聲光電刺激大鼠進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練10 m/min×5 min→15 m/min×10 min→10 m/min×5 min，逐步取消刺激因素，大鼠自主完成訓(xùn)練。跑臺(tái)訓(xùn)練干預(yù)8周，每周5 d，每天30 min，17：00～20：00進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練負(fù)荷按照適應(yīng)性低強(qiáng)度(15 m/min×10 min)→大強(qiáng)度(20 m/min×10 min)→恢復(fù)性低強(qiáng)度(15 m/min×10 min)這三個(gè)階段連續(xù)完成，訓(xùn)練中的大強(qiáng)度每?jī)芍茉黾右淮?，每次增? m/min，直到強(qiáng)度達(dá)到30 m/min不再增加。

1.4 取材

10周后進(jìn)行取材，將大鼠斷頭后迅速取出大鼠全腦，剝離干凈后置于液氮15 min，取出后置于-20℃冰箱冷凍，用于免疫組織化學(xué)切片檢測(cè)。

1.5 指標(biāo)測(cè)試

采用免疫組織化學(xué)的方法測(cè)定內(nèi)側(cè)下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)5-HT1A受體、5-HT2A受體的變化。大腦組織石蠟包埋后，5 μm厚連續(xù)切片，參照Paxinos&Watson《大鼠腦立體定位圖譜》，從每只鼠的切片中選取包含完整的導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)及內(nèi)側(cè)下丘腦區(qū)域且具有相同切面的切片10張。經(jīng)過(guò)常規(guī)脫蠟；CB液抗原修復(fù)；3% H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；山羊血清封閉；一抗4℃孵育過(guò)夜；二抗(IgG/Bio)37℃孵育1 h；辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(S-A/HRP)37℃孵育1 h；DAB顯色1～30 min；脫水、透明、封片。

每張切片同一腦區(qū)在10×20光鏡下隨機(jī)選取視野，計(jì)算出相同視野中陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值(MOD)。選取標(biāo)準(zhǔn)：不論染色深淺，只要細(xì)胞符合DAB特征染色，即陽(yáng)性神經(jīng)元胞核呈棕黃色，與背景區(qū)分明顯，就可認(rèn)定其為免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)內(nèi)側(cè)下丘腦(MH)和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(PAG)5-HT1A受體蛋白表達(dá)的影響

MH中5-HT1A受體的變化：與A組相比，G組MH中5-HT1A受體蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與G組相比，GP組MH中5-HT1A受體蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05，表1，圖1)。

Tab. 1 Average optical density values of 5-HT1A receptor and 5-HT2A receptor expression in MH and PAG(OD value, n=10)

Fig. 1 Immunohistochemistry maps of 5-HT1A receptor in MH(×200)

PAG中5-HT1A受體的變化：與A組相比，G組PAG中5-HT1A受體蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與G組相比，GP組PAG中5-HT1A受體蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05，表1， 圖2)。

Fig. 2 Immunohistochemistry maps of 5-HT1A receptor in PAG(×200)

2.2 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)內(nèi)側(cè)下丘腦(MH)和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(PAG)5-HT2A受體蛋白表達(dá)的影響

MH中5-HT2A受體的變化：與A組相比，G組MH中5-HT2A受體蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與G組相比，GP組MH中5-HT2A受體蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，表1，圖3)。

PAG中5-HT2A受體的變化：與A組相比，G組PAG中5-HT2A受體蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與G組相比，GP組PAG中5-HT2A受體蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，表1，圖4)。

Fig. 3 Immunohistochemistry maps of 5-HT2A receptor in MH(×200)

Fig. 4 Immunohistochemistry maps of 5-HT2A receptor in PAG(×200)

3 討論

5-羥色胺能神經(jīng)系統(tǒng)在運(yùn)動(dòng)調(diào)控中起著重要作用，通過(guò)向小腦頂核微量注射5-HT后，大鼠在Rota-rod走步機(jī)運(yùn)動(dòng)成績(jī)顯著提高，而在小腦頂核注射5-HT1B 的阻斷劑SB224289后，大鼠運(yùn)動(dòng)成績(jī)顯著降低，阻斷5-HT1B受體能夠增強(qiáng)小腦頂核興奮性突觸傳遞[8]。5-羥色胺是與攻擊行為和沖動(dòng)行為改變密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，低水平的5-羥色胺與攻擊行為和沖動(dòng)行為增加緊密聯(lián)系[9]。大腦結(jié)構(gòu)包括下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)幕屹|(zhì)，杏仁核、海馬結(jié)構(gòu)、中隔區(qū)、前額葉皮層和前扣帶回等邊緣結(jié)構(gòu)對(duì)攻擊行為表達(dá)具有重要的調(diào)節(jié)功能。防御性攻擊行為的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)內(nèi)側(cè)下丘腦內(nèi)神經(jīng)元和谷氨酸能下行通路到中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)，反之，通過(guò)谷氨酸上行通路神經(jīng)元反饋到內(nèi)側(cè)下丘腦[6]。調(diào)節(jié)攻擊行為的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，包括通過(guò)5-HT1受體發(fā)揮作用的GABA、腦啡肽和5-羥色胺；增強(qiáng)憤怒行為的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，包括通過(guò)5-HT2受體發(fā)揮作用的興奮性氨基酸、P物質(zhì)、兒茶酚胺、膽囊收縮素、加壓素和5-羥色胺。

在內(nèi)側(cè)下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)，5-HT1A受體的激活選擇性抑制防御性攻擊行為，5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT 能夠改善慢性應(yīng)激所致的大鼠病理性攻擊行為[10]，在嚙齒類(lèi)內(nèi)側(cè)下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)5-HT1A受體蛋白表達(dá)和5-HT1A受體的激動(dòng)劑均可發(fā)揮有力的抗攻擊性行為，尤其5-HT1A受體激動(dòng)劑的使用，使5-羥色胺能系統(tǒng)抑制性神經(jīng)沖動(dòng)增加，表現(xiàn)出攻擊行為的減少[11]，5-HT1A受體激動(dòng)劑可上調(diào)前額葉皮質(zhì)及海馬內(nèi)BDNF、GDNF的蛋白表達(dá)，并在一定程度上減輕慢性應(yīng)激所致青春期大鼠病理性攻擊行為[12]。本文結(jié)果表明，G組大鼠內(nèi)側(cè)下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)5-HT1A受體蛋白表達(dá)明顯降低，大鼠攻擊行為增加，經(jīng)過(guò)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，GP組5-HT1A受體在內(nèi)側(cè)下丘腦表達(dá)明顯增加，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠攻擊行為有一定的緩解作用[7]，可能是由于運(yùn)動(dòng)激活了5-羥色胺能系統(tǒng)，上調(diào)5-HT1A 受體的表達(dá)水平，使5-HT1A 受體的抑制性神經(jīng)傳遞增強(qiáng)[13]。

近年來(lái)，5-HT2A受體在不同的心理學(xué)和精神病學(xué)研究中作為一個(gè)重要的受體，特別是改變5-HT2A受體的表達(dá)與精神分裂癥、情緒紊亂、焦慮癥、強(qiáng)迫癥等的關(guān)系[14]備受關(guān)注。據(jù)報(bào)道，含有5-HT2A受體亞型成分較高的非典型性抗精神病藥能夠降低青年精神病患者攻擊行為的爆發(fā)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)使用傳統(tǒng)的草藥YKS可以降低前額葉皮層中5-HT2A受體的表達(dá)水平，改善攻擊行為[16]。采用電刺激中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(PAG)誘導(dǎo)防御性攻擊行為，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)側(cè)下丘腦與PAG這兩個(gè)任何一區(qū)域，激活5-HT2A受體促進(jìn)防御性攻擊行為[17]。本文結(jié)果表明，G組大鼠內(nèi)側(cè)下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)中5-HT2A受體蛋白表達(dá)均顯著增高，在其他攻擊模型中也發(fā)現(xiàn)，激活5-HT2A受體可能會(huì)誘發(fā)攻擊行為，5-HT2A受體拮抗作用可降低攻擊行為[18]，經(jīng)過(guò)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，GP組內(nèi)側(cè)下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)中5-HT2A受體蛋白表達(dá)均顯著降低，5-HT2A受體興奮性神經(jīng)傳遞降低，可能是大鼠攻擊行為降低的原因之一。

綜上所述，在攻擊模型中，大鼠內(nèi)側(cè)下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)5-HT1A受體蛋白表達(dá)降低，5-HT2A受體蛋白表達(dá)增高。通過(guò)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，攻擊行為大鼠內(nèi)側(cè)下丘腦5-HT1A受體蛋白表達(dá)增高，內(nèi)側(cè)下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)5-HT2A受體蛋白表達(dá)降低。由于跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)可引起5-HT1A受體介導(dǎo)的抑制性神經(jīng)傳遞增強(qiáng)，5-HT2A受體介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)傳遞降低，據(jù)此可以推測(cè)出跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)攻擊行為有一定的改善作用，后期還需要進(jìn)一步探索更有效的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷周期，研究跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)攻擊行為的積極作用及相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制。