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    黃芪湯對(duì)延緩12C6+離子輻射致大鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制*

    2021-10-25 05:59:02安方玉顏春魯劉永琦王彩霞楊雙紅蔣國(guó)鳳
    關(guān)鍵詞:重離子腦損傷黃芪

    安方玉, 顏春魯, 劉永琦, 王彩霞, 蘇 韞, 石 彪,楊雙紅, 郭 丹, 蔣國(guó)鳳

    (1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心, 蘭州 730000; 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院, 蘭州 730000; 3. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,蘭州 730000; 4. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 蘭州 730000; 5. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 蘭州 730000; 6. 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730000; 7. 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730000)

    重離子是不同于X-射線和γ-射線的重離子具有高傳能線密度和形成特征性布喇格峰的一種射線,其能量釋放是隨深度的不同呈現(xiàn)出指數(shù)增加或減小的特點(diǎn)[1],近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于腫瘤患者的治療。但是近年來(lái)也發(fā)現(xiàn),重離子抗癌的同時(shí),也會(huì)對(duì)機(jī)體正常組織誘發(fā)輻射損傷,嚴(yán)重影響著腫瘤患者的生存質(zhì)量。據(jù)報(bào)道,輻射在造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的同時(shí),能影響其調(diào)控的外周靶器官,使外周靶器官產(chǎn)生旁效應(yīng)[2-3]。因此,尋找安全、低毒、高效的輻射防護(hù)劑顯得尤為迫切。中醫(yī)將輻射歸屬于“毒邪”范疇[4],并認(rèn)為氣血兩虛及血瘀是重離子輻射的基本病機(jī)。選自《醫(yī)學(xué)心悟》中的經(jīng)方黃芪湯具有益氣滋陰,生津養(yǎng)血之功效,可能起到防護(hù)輻射損傷的作用。為了進(jìn)一步探討黃芪湯防輻射的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Wistar大鼠腦組織給予4Gy12C6+離子束單次照射復(fù)制重離子輻射腦損傷動(dòng)物模型,觀察黃芪湯對(duì)12C6+離子輻射腦損傷模型大鼠Bcl-2/NF-κB信號(hào)通路的干預(yù)作用,初步探討黃芪湯對(duì)12C6+離子輻射腦損傷模型大鼠旁效應(yīng)臟器腎組織細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制,為輻射損傷的臨床輔助用藥提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    選取體質(zhì)量為(180±20)g的50只雌雄各半的SPF級(jí)Wistar大鼠,購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK(甘)2015-0002,所有動(dòng)物自由飲水、攝食1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的嚴(yán)格審查。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑

    黃芪湯方中的黃芪、熟地、麥冬、人參、枸杞子和五味子均購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司,批號(hào)分別為:H7806580 和H7825375);引物β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3(TaKaRa 寶生物工程(大連) 有限公司設(shè)計(jì)并合成);引物β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3序列見(jiàn)表1。;大鼠IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司,批號(hào)為:1812R);兔抗大鼠Bcl-2 抗體(美國(guó) Gene Tex公司,批號(hào):42970);兔抗大鼠Bax 抗體(美國(guó) Gene Tex公司,批號(hào):39988);兔抗大鼠Caspase-3 抗體(美國(guó) Gene Tex公司,批號(hào):42753);GAPDH抗體(美國(guó) Gene Tex公司,批號(hào):41323);兔抗大鼠NF-κB 抗體(Immuno Way公司,批號(hào):B1101)。

    Tab. 1 Primer sequences for RT-PCR

    1.3 主要儀器

    MultiskanSky型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(北京昊諾斯科技有限公司);美國(guó) Q5000 超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海在途生物科技有限公司);PCR熱循環(huán)儀(上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司); 7500型實(shí)施熒光定量PCR擴(kuò)增儀(上海興曼生物科技有限公司);Western blot分析儀(BIO-RAD);BX53型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)藥物給藥劑量

    黃芪湯方中的所有中藥原藥材均由本校甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量研究室進(jìn)行質(zhì)量鑒定。黃芪湯由30 g黃芪、15 g熟地黃、15 g麥冬、15 g人參、15 g枸杞子和10 g五味子組成,人的臨床用量為:100 g/d,按照人與大鼠的體表面積換算法:100 g×0.018×5=9.0 g/(kg·d),作為中劑量。則黃芪湯高、中、低劑量分別為18、9、4.5 g/(kg·d)。

    1.5 動(dòng)物分組、給藥及造模

    SPF級(jí)Wistar大鼠自由飲水、攝食1周后,隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組,單純輻射模型組,黃芪湯高、中、低劑量組,每組10只。正常對(duì)照組和單純輻射模型組給予等體積生理鹽水灌胃(10 ml/(kg·d)),黃芪湯高、中、低劑量組給予黃芪湯灌胃(劑量為18、9、4.5 g/(kg·d)),連續(xù)14日。第8日腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉各組大鼠,除正常對(duì)照組大鼠外,其余各組大鼠腦組織均給予4Gy12C6+離子束單次照射[5]。重離子照射是在中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所完成的,照射過(guò)程中的束流為12C6+離子束,照射過(guò)程中的能量、線性能量傳遞(LET)、吸收劑量和照射劑量等設(shè)置根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]實(shí)施。輻射后第7日稱量各組大鼠的體質(zhì)量后,股動(dòng)脈采血處死各組大鼠,分離血清,摘取腎組織備用。

    1.6 動(dòng)物體質(zhì)量及腎臟指數(shù)測(cè)定

    用生理鹽水沖洗腎組織并用吸水紙吸干后稱重,計(jì)算大鼠的腎指數(shù)。大鼠腎臟指數(shù)(%)=腎質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。

    1.7 腎臟形態(tài)學(xué)變化觀察

    將上述稱重后的左腎組織放在4%多聚甲醛固定液中24 h,常規(guī)經(jīng)過(guò)脫水、固定、包埋、脫蠟、沖洗等步驟后蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察腎組織結(jié)構(gòu)改變。

    1.8 ELISA 法測(cè)定血清IL-6含量

    股動(dòng)脈采血留取的血液靜置2 h后,2 500 r/min,離心10 min,制備血清。ELISA法測(cè)定血清IL-6的含量。具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1.9 RT-PCR觀察腎臟Bcl-2、Bax和caspase-3的基因表達(dá)

    右腎組織RNA提取用 4℃的Trizol試劑,提取后立即上機(jī)測(cè)定RNA含量和OD260/OD280的比值。RT-PCR法合成模板cDNA后,以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),具體反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性2 min,95℃變性40 s,58℃退火50 s,60℃延伸2 min。共 42個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每個(gè)樣品至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,用 2-△△Ct來(lái)表示基因相對(duì)表達(dá)含量。

    1.10 免疫組化法觀察腎臟Bcl-2、Bax、Caspase-3和NF-κB 的蛋白表達(dá)

    將脫蠟后的大鼠腎組織石蠟切片用3% H2O2進(jìn)行封閉、然后經(jīng)過(guò)微波修復(fù)、血清封閉,(1∶200、1∶100、1∶300、1∶200)的兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3和NF-κB一抗 4℃ 孵育過(guò)夜,(1∶1500)二抗37℃孵育、DAB顯色等步驟完成免疫組化染色。染色判定依據(jù)為腎小管和腎間質(zhì)胞漿出現(xiàn)棕色顆粒為染色陽(yáng)性[6]。在顯微鏡下采集腎組織Bcl-2、Bax、Caspase-3和NF-κB的蛋白表達(dá)進(jìn)行拍照。用免疫組化數(shù)據(jù)分析軟件 Image proplus 6.0 對(duì)各組照片的染色結(jié)果進(jìn)行分析,每組隨機(jī)選取10張切片,每張切片連續(xù)選取3個(gè)不同視野,將10張切片中每張切片連續(xù)3個(gè)不同視野得出的光密度值再取其平均數(shù)即為平均積分光密度(integrated optical density,IOD)

    1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦損傷模型大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響

    表2結(jié)果顯示,單純輻射模型組大鼠體質(zhì)量和腎臟指數(shù)較正常對(duì)照組均明顯下降(P<0.01);黃芪湯高劑量組大鼠體質(zhì)量和腎臟指數(shù)較單純輻射模型組均顯著升高(P<0.05)。

    Tab. 2 Effects of Huangqi decoction on the weight and renal index in rats induced by 12C6+ radiation n=10)

    2.2 黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦損傷模型大鼠腎組織形態(tài)學(xué)影響

    圖1結(jié)果顯示,正常對(duì)照組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常;單純輻射組腎小球系膜細(xì)胞明顯增生,腎小管間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張充血,腎小管管腔狹窄、不規(guī)則。黃芪湯低、中劑量組黃芪湯可見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞明顯增生,腎小管間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張充血,腎小管排列紊亂;黃芪湯高劑量組可見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞增生情況明顯改善,腎小管輪廓清晰。

    Fig. 1 Effects of Huangqi decoction on the pathomorphological changes of renal tissues in rats induced by 12C6+ radiation brain (HE ×20)

    2.3 黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦損傷模型大鼠血清IL-6含量的影響

    表3結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,單純輻射模型組大鼠血清IL-6含量顯著升高(P<0.01);與單純輻射模型組比較,黃芪湯各干預(yù)組大鼠血清IL-6含量顯著降低(P<0.05,P<0.01)。

    Tab. 3 Effects of Huangqi decoction on the serum content of IL-6 in rats induced by 12C6+ radiation n=10)

    2.4 黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦損傷模型大鼠腎臟Bcl-2、Bax和caspase-3基因表達(dá)的影響

    表4結(jié)果顯示,單純輻射模型組大鼠腎組織Bcl-2基因表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低,Bax和caspase-3基因表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高(P< 0.01);黃芪湯各干預(yù)組大鼠腎組織Bcl-2基因表達(dá)較單純輻射模型組顯著升高,Bax和caspase-3基因表達(dá)較單純輻射模型組顯著降低(P<0.01)。

    Tab. 4 Effects of Huangqi decoction on the gene expressions of Bcl-2, Bax and caspase-3 of renal tissue in rats induced by 12C6+ radiation n=10)

    2.5 黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦損傷模型大鼠腎臟Bcl-2、Bax 、caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

    表5結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,單純輻射模型組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),Bax、Caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01);與單純輻射模型組大鼠比較,黃芪各干預(yù)組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01),中、高劑量組大鼠Bax、Caspase-3和黃芪各干預(yù)組大鼠NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01, 圖2-5)。

    Tab. 5 Effects of Huangqi decoction on the IOD vslue of protein expressions of Bcl-2, Bax, Caspase-3 and NF-κB of renal tissues in rats induced by 12C6+ radiation brain(IOD, n=10)

    Fig. 2 Effects of Huangqi decoction on the Bcl-2 protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

    Fig. 3 Effects of Huangqi decoction on the Bax protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

    Fig. 4 Effects of Huangqi decoction on the Caspase-3 protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

    Fig. 5 Effects of Huangqi decoction on the NF-κB protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

    3 討論

    放療是目前惡性腫瘤的主要治療手段之一,其主要并發(fā)癥是輻射性損傷。中醫(yī)將這種輻射損傷歸屬于“熱毒”范疇。中醫(yī)認(rèn)為熱毒熾盛直中臟腑,消耗人體正氣,導(dǎo)致氣血虧虛,痰瘀血瘀、臟腑功能失調(diào)。治法以“補(bǔ)氣生津、活血化瘀”為主。黃芪湯主要由黃芪 30 g、熟地黃15 g、麥冬15 g、人參15 g、枸杞子15 g,五味子10 g配伍而成。方中熟地黃、枸杞子具有滋補(bǔ)肝腎、滋陰清熱功效;五味子具有滋腎養(yǎng)陰,益氣生津功效;麥冬具有潤(rùn)肺清心,養(yǎng)陰生津功效;黃芪具有補(bǔ)中益氣功效;人參大補(bǔ)元?dú)?,具有補(bǔ)脾益肺,生津養(yǎng)血功效。諸藥合奏發(fā)揮益氣滋陰,生津養(yǎng)血之功效。根據(jù)方解分析,黃芪湯對(duì)重離子輻射損傷能夠起到防護(hù)作用。且有研究發(fā)現(xiàn)[7],12C6+束照射大鼠輻射損傷模型的中醫(yī)證候?qū)傩允菤怅巸商撟C,黃芪湯對(duì)12C6+束照射導(dǎo)致的氣陰兩虛證具有明顯的緩解作用,但是其具體的分子機(jī)制未明。

    NF-κB是一個(gè)參與細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖基因的轉(zhuǎn)錄,以及調(diào)控多種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的多功能轉(zhuǎn)錄因子,主要是以形成P50-P65 異源二聚體來(lái)發(fā)揮生理功能的。通常情況下,NF-κB 與 IκB 以三聚體的無(wú)活性方式存在于細(xì)胞漿中。當(dāng)受到炎癥因子(IL-1α、IL-1β)、細(xì)菌脂多糖、受損細(xì)胞釋放的產(chǎn)物等刺激時(shí),使三聚體中IκB發(fā)生磷酸化被蛋白水解酶水解,促進(jìn)了NF-κB 的釋放并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,入核的NF-κB結(jié)合細(xì)胞核基因上的 κB 位點(diǎn),又會(huì)調(diào)控一系列炎癥性細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-12 /23)、趨化因子 (IL-8、MIP-1α、MCP-1)、NO產(chǎn)物、黏附分子(ICAM、VCAM、E-選擇素) 等的基因表達(dá),調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[8-9]。IL-6是由T、B淋巴細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌,主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫反應(yīng)的多向潛能因子[10],是判定炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)之一。本研究結(jié)果表明,單純輻射模型組腎小球系膜細(xì)胞明顯增生,腎小管間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張充血,腎小管管腔狹窄、不規(guī)則。單純輻射模型組體質(zhì)量和腎指數(shù)均明顯降低,IL-6含量和NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高,預(yù)先給予12C6+輻射腦損傷大鼠黃芪湯灌胃的結(jié)果顯示,黃芪湯高劑量組大鼠的體質(zhì)量和腎臟指數(shù)明顯增加,腎組織病理?yè)p傷程度明顯減輕,黃芪湯各干預(yù)組大鼠血清IL-6含量和腎組織NF-κB蛋白表達(dá)均明顯下降。說(shuō)明黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦模型鼠誘發(fā)的旁效應(yīng)器官腎病理?yè)p傷具有減緩作用,機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路的炎癥因子IL-6的分泌有關(guān)。

    受重離子照射的中樞神經(jīng)系統(tǒng)極易引起周圍靶器官的損傷,而腎臟是屬于放射中樞神經(jīng)系統(tǒng)旁效應(yīng)靶器官損傷中最敏感組織。NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路的激活可能是引起腎損傷的關(guān)鍵因素。激活的NF-κB入核后可調(diào)控下游凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax及細(xì)胞增殖相關(guān)基因Cyclin D1 的轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控[11-12]。Bcl-2是屬于Bcl-2 家族的抗凋亡蛋白,Bax是屬于Bcl-2 家族的促凋亡蛋白,Caspase-3是Bcl-2 家族通過(guò)線粒體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡的下游促凋亡蛋白[13-15]。在線粒體凋亡調(diào)控通路中,當(dāng)Bax形成Bax-Bax同源二聚體時(shí)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡,當(dāng)Bax形成Bax-Bcl-2異源二聚體時(shí)會(huì)抑制細(xì)胞凋亡[15]。重離子輻射會(huì)激活機(jī)體受損組織的Bax過(guò)度表達(dá),過(guò)度表達(dá)的Bax可通過(guò)線粒體途徑激活下游的Caspase-3, 激發(fā)Caspase發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)受損組織的細(xì)胞凋亡[16]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出,單純輻射模型組大鼠腎臟的Bcl-2的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)在12C6+離子輻射后7d均顯著降低,而腎臟的Bax、Caspase-3的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)及NF-κB的蛋白表達(dá)則在12C6+離子輻射后7d均顯著升高,與以往的研究基本相符[5,17-18];而預(yù)先給予黃芪湯干預(yù)的結(jié)果則顯示,黃芪湯中、高劑量組腎組織的Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)均顯著降低,黃芪湯各干預(yù)組腎組織的Bcl-2的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)均顯著升高、Bax和Caspase- 3腎組織的基因表達(dá)均顯著降低,NF-κB腎組織的蛋白表達(dá)也均顯著降低。說(shuō)明,黃芪湯通過(guò)調(diào)控Bcl-2/NF-κB信號(hào)通路中的Bcl-2、Bax和Caspase-3,以其多藥效部位多作用靶點(diǎn)的形式參與12C6+離子輻射后腎臟細(xì)胞凋亡,發(fā)揮其抗輻射損傷的作用。

    綜上,黃芪湯可能是通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路中Bcl-2表達(dá)水平的上調(diào)和Bax、Caspase-3、NF-κB的表達(dá)水平的下調(diào),以抑制重離子輻射腦模型鼠受損腎的細(xì)胞凋亡,也可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的炎癥因子IL-6的分泌來(lái)抑制腎的炎癥反應(yīng),從而進(jìn)一步延緩受損腎組織的病理形態(tài)改變,發(fā)揮對(duì)輻射的干預(yù)作用。本文從NF-κB信號(hào)通路的凋亡和炎癥反應(yīng)的雙向調(diào)控靶點(diǎn)上對(duì)黃芪湯的干預(yù)機(jī)制進(jìn)行了初探,以期為輻射防護(hù)劑的研發(fā)提供新的思路。

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