沙棘粕槲皮素體外抗氧化及對(duì)衰老模型小鼠保護(hù)作用的研究

沈曉溪，張一鳴，趙梓伊，石晨暉，尚宏麗

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121001）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.），為沙棘屬落葉性灌木，廣泛分布于西北地區(qū)，是新疆阿勒泰地區(qū)特色高原水果。沙棘為“藥食同源”植物[1]，沙棘粕是沙棘籽經(jīng)過油脂處理后的副產(chǎn)物，一般作為廢棄物或飼料丟棄，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)[2]。由前人研究表明，沙棘粕含有大量的活性物質(zhì)，像維生素、脂類、多酚類及黃酮類等，具有抗菌、抗氧化、降血脂和免疫調(diào)節(jié)作用[3]；其中黃酮類化合物具有多種藥理作用和活性功能[4]。

衰老是一種生物體自發(fā)的必然現(xiàn)象[5]。機(jī)體代謝減緩，記憶力和抵抗力衰退就是人體衰老在生理上的主要體現(xiàn)[6]。雖然衰老是無法避免的，但隨著科技的不斷發(fā)展，延緩衰老有著無限的可能[7]。有研究表明：黑果枸杞葉槲皮素對(duì)10 Gy的X射線及碳離子輻照引起的衰老細(xì)胞發(fā)生凋亡，具有明顯抗衰老作用[8]；桑葉槲皮素能夠使D-半乳糖衰老模型小鼠總抗氧化能力提高，脂質(zhì)過氧化物含量降低，同時(shí)能明顯改善衰老小鼠腸道菌群的多樣性，并提高機(jī)體的生理功能[9]。槲皮素是沙棘粕重要的黃酮類化合物之一[10]，槲皮素作為天然抗氧化劑，能對(duì)抗自由基，防止機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，不具有毒性，常用作抗衰老劑[11?12]，但是作用機(jī)制尚不清楚。

因此，本實(shí)驗(yàn)以沙棘粕槲皮素為研究對(duì)象采用清除DPPH·、、ABTS+·的體外抗氧化方法及FRAP還原力的測(cè)定，比較沙棘粕槲皮素與VC、蘆丁的抗氧化能力。同時(shí)，注射D-半乳糖來建立衰老小鼠模型，研究沙棘粕槲皮素對(duì)小鼠眼球血清中總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）及脂質(zhì)過氧化物（MDA）含量的影響，同時(shí)結(jié)合心臟、腎臟和肝臟組織病理切片，評(píng)價(jià)沙棘粕槲皮素對(duì)衰老模型小鼠的保護(hù)作用，為進(jìn)一步將沙棘粕槲皮素開發(fā)利用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘粕 青海康普生物科技股份有限公司；VC（純度>95%）、VE（純度>95%）、蘆丁（純度：96%）維斯登生物集團(tuán)；60只KM雄性小鼠 錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（遼）2014-0004；DPPH· 中國大茂化學(xué)公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鐵，硫酸亞鐵、碳酸鈉錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室；ABTA溶液、高硫酸鉀、醋酸銨、鄰苯三酚 天津試劑化學(xué)廠；D-半乳糖 北京國藥試劑集團(tuán)；T-AOC、GSH-PX、SOD、MDA測(cè)試盒南京建成生物工程研究所；

203-00T電熱鼓風(fēng)干燥箱 江蘇光合實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；HH-420恒溫水浴鍋 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Biomate3S型紫外分光光度計(jì) 鴻運(yùn)實(shí)驗(yàn)儀器批發(fā)中心；SN-LSC-1高速冷凍離心機(jī)江蘇光合實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；UV-VIS多功能酶標(biāo)儀 浙江新豐實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；IKA RV 10數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 安捷倫科技有限公司；AE-31電子顯微鏡 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；96孔酶標(biāo)板、移液槍 錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘粕槲皮素的制備 參照Zheng等[13]、童鈺琴等[14]的方法，稱取5 g沙棘粕置于100 mL錐形瓶中，加入95%乙醇15 mL，放入超聲波提取器中，在超聲功率350 W，超聲溫度60 ℃的情況下超聲30 min后，過濾除渣，用真空泵減壓濃縮，回收乙醇溶液并定容至50 mL,獲得粗提物，沙棘粕槲皮素含量為2.4 mg/mL。粗提物蒸發(fā)濃縮后通過NKA-Ⅱ樹脂柱進(jìn)行純化，設(shè)置流速為2.5 BV/h，先用蒸餾水洗脫除雜，再用體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液以1.5 BV/h流速洗脫，流出液為無色時(shí)代表洗脫完成，并收集洗脫液。利用旋蒸法將多余乙醇除去，?50 ℃下冷凍，干燥后，備用。

1.2.2 DPPH·清除率的測(cè)定 參照孫麗萍[15]、Zhou等[16]的方法。配制0.5 mol/L槲皮素溶液，0.1 mmol/L DPPH貯備液，并將其裝入棕色瓶中放置于陰涼處，備用。將2 mL槲皮素溶液與1 mL DPPH貯備液快速搖勻充分反應(yīng)，并在517 nm處測(cè)吸光值（調(diào)零用無水乙醇溶液）。以VC、蘆丁為陽性對(duì)照，用乙醇替代沙棘粕槲皮素作對(duì)照組，蒸餾水為參比溶液。計(jì)算DPPH·的清除率。

式中：A0是未加樣品的吸光值；Ai是加樣品后的吸光值；Aj為樣品本身的吸光值。

式中：A0是未加樣品的吸光值；Ai是加樣品后的吸光值；Aj為樣品本身的吸光值。

1.2.4 ABTS+·清除率的測(cè)定 參照孟慶煥[19]、Liu等[20]的方法。配制ABTS工作液：取ABTS儲(chǔ)備液（0.7 mol/L）3 mL與0.5 mL K2S2O8（2.5 mol/L）混勻，室溫放置14 h。用磷酸緩沖鹽溶液稀釋0.5 mL ABTS工作液，要求室溫下734 nm處吸光度為0.700±0.035。配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的沙棘粕槲皮素溶液，將1.0 mL ABTS工作液分別與0.5 mL不同濃度沙棘粕槲皮素溶液混勻，室溫下靜置20 min后，734 nm處測(cè)其吸光度（蒸餾水調(diào)零）。蒸餾水作為空白對(duì)照并以VC、蘆丁對(duì)比，計(jì)算ABTS+·的清除率。

式中：A0是未加樣品的吸光值；Ai是加樣品后的吸光值；Aj為樣品本身的吸光值。

1.2.5 高鐵離子還原/抗氧化力（FRAP）的測(cè)定 還原力的測(cè)定按照FRAP法進(jìn)行[21]，用鹽酸溶液（0.6 mol/L）配制0.2 mol/L的TPTZ溶液。將8 mL醋酸鹽緩沖液（0.3 mol/L, pH=4.7）、1 mL的TPTZ溶液和0.1 mol/L氯化鐵溶液搖勻混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。取2.0 mL FRAP溶液，加入0.5 mL的超純水和0.2 mL的沙棘粕槲皮素溶液，將其搖勻，40 ℃水浴加熱30 min，在593 nm處測(cè)吸光值。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L的硫酸鐵溶液，替代樣品溶液并進(jìn)行同上操作，蒸餾水作為空白對(duì)照并以VC、蘆丁對(duì)比，根據(jù)吸光值計(jì)算出沙棘粕槲皮素相比較于硫酸鐵的高鐵離子還原/抗氧化力。

1.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 正常飼養(yǎng)8 d后的60只昆明小鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對(duì)照組、沙棘粕槲皮素低、中、高劑量組。除正常組每天頸部注射生理鹽水外，其它組均注射D-半乳糖（200 mg/kg）；正常組和模型組灌胃蒸餾水，陽性對(duì)照組灌胃VE溶液150 mg/kg，根據(jù)前人研究[22?24]，確定槲皮素低、中、高灌胃劑量分別為100、250、500 mg/kg，連續(xù)注射和灌胃8周。試驗(yàn)期間，不限制小鼠進(jìn)食和飲水。

1.2.7 小鼠血清中T-AOC、GSH-PX、SOD活力及MDA含量測(cè)定 末次給藥后，禁食不禁水，12 h后摘小鼠眼球取血，并將其斷頸處死。低溫條件下，血漿靜置15 min后，使用離心機(jī)設(shè)置3500 r/min離心10 min后，取上清液。按照試劑盒說明測(cè)其指標(biāo)。

1.2.8 病理切片觀察 取小鼠心臟、腎臟和肝臟組織，用生理鹽水洗凈血跡后，放置福爾馬林中固定，用80%、85%、90%、100%乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，HE染色后，用中性樹膠封住切片，電子顯微鏡下觀察組織變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Xˉ±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘粕槲皮素抗氧化能力分析

2.1.1 沙棘粕槲皮素、VC和蘆丁對(duì)DPPH·的清除能力 如圖1所示，在0.5~2.5 mg/mL內(nèi)，沙棘粕槲皮素清除DPPH·的能力同VC、蘆丁一樣逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度為2.5 mg/mL時(shí)，沙棘粕槲皮素對(duì)DPPH·清除率達(dá)到42.5%，稍強(qiáng)于蘆丁的清除能力但低于VC。當(dāng)濃度大于2.5 mg/mL時(shí)，隨著濃度的增加，三者對(duì)DPPH·清除率變化趨于平穩(wěn)。由此得出，在同等濃度區(qū)間內(nèi)沙棘粕槲皮素對(duì)DPPH·有良好的清除能力，其能力強(qiáng)于蘆丁但弱于VC。石艷賓等[25]研究表明，金銀花槲皮素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，其清除DPPH·的能力隨濃度的增加而升高，與本研究結(jié)果一致。

圖1 沙棘粕槲皮素、VC和蘆丁對(duì)DPPH·的清除能力Fig.1 Scavenging ability of quercetin, VC and rutin from seabuckthorn meal on DPPH·

2.1.2 沙棘粕槲皮素、VC和蘆丁對(duì)的清除能力如圖2所示，在0.5~4.5 mg/mL內(nèi)，三者對(duì)清除率隨著濃度的增大而升高。在相同濃度下對(duì)的清除率表現(xiàn)為VC>沙棘粕槲皮素>蘆丁。由此得出，沙棘粕槲皮素能有效清除，其清除率高于蘆丁但低于VC。有研究報(bào)道[26]槲皮素是沙棘果渣中重要的黃酮類化合物之一，具有較好的抗氧化能力，其清除的能力隨著槲皮素含量的增加而提高。

2.1.3 沙棘粕槲皮素、VC和蘆丁對(duì)ABTS+·的清除能力 如圖3所示，隨著濃度的增加，三者對(duì)ABTS+·的清除能力與濃度存在量效關(guān)系。當(dāng)濃度為4.5 mg/mL時(shí)，沙棘粕槲皮素、VC和蘆丁的清除率均達(dá)到最高值，分別是70.4%、93.5%和63.5%。由此得出，沙棘粕槲皮素能有效清除ABTS+·，其清除能力與蘆丁作用相當(dāng)，但低于VC。肖穎等[27]研究顯示，槲皮素具有明顯的抗氧化作用，能有效清除ABTS+·，其清除能力與濃度成正比。

圖3 沙棘粕槲皮素、VC和蘆丁對(duì)ABTS+·的清除能力Fig.3 Scavenging ability of quercetin, VC and rutin from seabuckthorn meal on ABTS+·

2.1.4 沙棘粕槲皮素、VC和蘆丁的還原力 如圖4所示，沙棘粕槲皮素的還原力同VC、蘆丁一樣隨著濃度的增加而提高。當(dāng)濃度為4.5 mg/mL時(shí)，沙棘粕槲皮素、VC和蘆丁的還原力均達(dá)到最高值，分別為0.655、0.918和0.595。在濃度0.5~4.5 mg/mL范圍內(nèi)，VC的還原力顯著強(qiáng)于沙棘粕槲皮素和蘆丁（P<0.05），但沙棘粕槲皮素的還原力與濃度有著良好的線性關(guān)系。因此，沙棘粕槲皮素有較好的抗氧化力，其能力高于蘆丁。

圖4 沙棘粕槲皮素、VC和蘆丁的還原力Fig.4 Reducing power of quercetin, VC and rutin in seabuckthorn meal

2.2 沙棘果槲皮素對(duì)衰老小鼠血清中T-AOC、GSHPX、SOD活力及MDA含量的影響

T-AOC是評(píng)價(jià)總抗氧化能力的重要指標(biāo)，GSHPX是機(jī)體重要的抗氧化酶[28]；SOD是人體清除和抵御氧自由基損害的重要物質(zhì)[29]，三者活性大小與機(jī)體清除自由基的能力成正比，自由基是導(dǎo)致機(jī)體衰老的主要原因，通過提高三者水平達(dá)到延緩衰老的作用[30]。MDA含量高低可以直接反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化速度和強(qiáng)度，是衰老的一種指標(biāo)[31]。由表1可知，與正常組比較，模型組在D-半乳糖作用下，小鼠血清中T-AOC、GSH-PX、SOD活力極顯著降低（P<0.01），MDA含量極顯著增加（P<0.01），表示衰老小鼠造模成功。與模型組相比，低劑量組的T-AOC、GSHPX、SOD活力均升高，但差異不顯著（P>0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）；中劑量組的T-AOC、GSHPX、SOD活力顯著提高（P<0.05），MDA含量極顯著降低（P<0.01）；高劑量組的T-AOC、GSH-PX、SOD活力極顯著增加（P<0.01），MDA含量極顯著降低（P<0.01），其中，GSH-PX和SOD活力高于陽性對(duì)照組，說明高劑量的沙棘粕槲皮素對(duì)小鼠抗衰老具有良好的效果，其抗氧化性高于VE。

表1 沙棘粕槲皮素對(duì)衰老小鼠血清中T-AOC、GSH-PX、SOD活力及MDA含量的影響Table 1 Effect of seabuckthorn fruit quercetin on the activities of T-AOC、GSH-PX、SOD and the content of MDA in serum of mice

2.3 沙棘粕槲皮素對(duì)衰老模型小鼠心臟組織的影響

本研究結(jié)果由圖5可知，正常組心肌纖維排列有序，橫紋清楚，細(xì)胞核核仁清晰可見，心肌纖維間血管結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞形態(tài)正常。模型組心肌纖維明顯排列紊亂，心肌細(xì)胞橫紋模糊，有明顯出血點(diǎn)，細(xì)胞核濃縮，間質(zhì)血管擴(kuò)張。陽性對(duì)照組中心肌細(xì)胞排列有序，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核仁明顯。槲皮素低劑量組心肌細(xì)胞形態(tài)比模型組稍強(qiáng)一些，心肌細(xì)胞數(shù)量較多，少量出血點(diǎn)。槲皮素中劑量組心肌纖維排列整齊，核仁清楚，間質(zhì)血管無擴(kuò)張現(xiàn)象，無出血點(diǎn)。槲皮素高劑量組心肌細(xì)胞形態(tài)接近于陽性對(duì)照組，肌原纖維間血管結(jié)構(gòu)清楚，排列規(guī)整，染色均勻?？傮w來說，沙棘粕槲皮素高劑量組能夠更好地抑制衰老模型小鼠心肌細(xì)胞損傷。

圖5 各組小鼠心臟組織切片HE染色結(jié)果（400×）Fig.5 Results of tissue slicing of heart sections by HE staining in each group（400×）

2.4 沙棘粕槲皮素對(duì)衰老模型小鼠腎臟組織的影響

本研究結(jié)果由圖6可知，正常組腎小囊和腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管數(shù)量多且排列緊密。模型組小鼠腎臟中腎小球分布不均勻，腎小囊腔顯著增大，基底膜增厚。陽性對(duì)照組腎臟組織形態(tài)接近于正常組。槲皮素低劑量組腎小球體積縮小，出現(xiàn)輕度細(xì)胞增生，腎小囊腔輕度增大，基底膜稍厚。槲皮素中、高劑量組與模型組相比，腎小球形態(tài)完整，腎小囊腔趨于正常大小，基底膜無明顯增厚現(xiàn)象?？傮w來說，隨著槲皮素濃度的增加，其抑制小鼠腎臟損傷的效果越好，所以，沙棘粕槲皮素高劑量組能夠更好地抑制衰老模型小鼠腎臟損傷。

圖6 各組小鼠腎臟組織切片HE染色結(jié)果（400×）Fig.6 Results of tissue slicing of kidney sections by HE staining in each group（400×）

2.5 沙棘粕槲皮素對(duì)衰老模型小鼠肝臟組織的影響

本研究結(jié)果由圖7可知，正常組肝細(xì)胞數(shù)量多且排列有序，核仁清晰，未發(fā)生病理改變。模型組肝細(xì)胞數(shù)量大量減少且排列無序，局部區(qū)域出現(xiàn)水腫，細(xì)胞核增大，竇間隙消失，包漿中出現(xiàn)大量顆粒性物質(zhì)。陽性對(duì)照組肝細(xì)胞排列緊密有序，胞核清晰，竇間隙顯著。槲皮素低劑量組肝細(xì)胞數(shù)量減少，少量細(xì)胞體積增大，水腫現(xiàn)象稍有改善，竇間隙變窄，包漿中有少量顆粒性物質(zhì)。槲皮素中劑量組肝細(xì)胞數(shù)量正常且排列整齊，未發(fā)生細(xì)胞水腫，竇間隙明顯。槲皮素高劑量組中肝細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞形態(tài)完整，竇間隙顯著。總體來說，隨著槲皮素濃度的增加，其抑制小鼠肝臟損傷的效果越好，所以，沙棘粕槲皮素高劑量組能夠更好地抑制衰老模型小鼠肝臟損傷。

圖7 各組小鼠肝臟組織切片HE染色結(jié)果（400×）Fig.7 Results of tissue slicing of liver sections by HE staining in each group（400×）

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了沙棘粕槲皮素體外抗氧化及對(duì)衰老模型小鼠的保護(hù)作用。通過測(cè)定清除DPPH自由基、自由基、ABTS+自由基及總還原力4個(gè)指標(biāo)，評(píng)價(jià)沙棘粕槲皮素體外抗氧化活性；通過注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型，觀察沙棘粕槲皮素對(duì)衰老小鼠的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，沙棘粕槲皮素具有良好的抗氧化能力，且體外抗氧化活性與濃度成正比。沙棘粕槲皮素對(duì)DPPH·清除率高達(dá)42.5%，對(duì)高達(dá)45.2%，對(duì)ABTS+·清除率高達(dá)70.4%，并且當(dāng)濃度為4.5 mg/mL時(shí)，還原力高達(dá)0.655。顯而易見，沙棘粕槲皮素清除ABTS+自由基最強(qiáng)，其次是O2-自由基，最后為DPPH自由基。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與正常組相比，模型組小鼠血清中T-AOC、GSH-PX、SOD活力極顯著降低（P<0.01），MDA含量升高（P<0.01）；與模型組比較，沙棘粕槲皮素低劑量組的MDA含量顯著降低（P<0.05），中、高劑量組小鼠血清中T-AOC、GSH-PX、SOD活力顯著升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05），說明沙棘粕槲皮素對(duì)小鼠有良好的抗衰老作用。從病理組織切片看，沙棘粕槲皮素能夠有效地抑制衰老模型小鼠心肌細(xì)胞、腎臟和肝臟的損傷。以上結(jié)果證明沙棘粕槲皮素對(duì)衰老小鼠具有良好的保護(hù)作用，為進(jìn)一步對(duì)沙棘粕槲皮素體外抗氧化和抗衰老作用的臨床研究提供支持。