方格星蟲低聚肽的分離、鑒定及其促骨發(fā)育作用評價

劉 珍，唐曉寧，吳科鋒,3，林芊杏,3，劉 歡，李 茜，張 茜，梅 思，戚 怡,3,

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江 524023；2.廣東湛江海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江 524023；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室，廣東湛江 510000）

方格星蟲常指星蟲動物科光裸方格星蟲[1]，俗稱沙蟲[2]，在兩廣地區(qū)有廣泛的分布和養(yǎng)殖，富含蛋白質(zhì)、牛磺酸、蟲草素等活性生物大分子[3]。具有滋陰降火、健脾去燥、清肺補虛、補腎壯陽等功效[4]，在民間，常用于治療腎虛腰痛、骨蒸潮熱、陰虛盜汗、肺虛咳喘、胸悶痰多和夜尿頻繁等癥狀。

方格星蟲中還含有18種氨基酸[5]。方格星蟲體內(nèi)含有各種生物天然活性成分[6]，有“海產(chǎn)冬蟲夏草”的美譽。有文獻指出，甾醇類、核苷類和酶類等成分是方格星蟲延緩衰老[7]、抗氧化[8]、抗血栓[9]、抗疲勞[10]、血管修復(fù)[11]、抗輻射損傷[12]、促進皮膚創(chuàng)傷修復(fù)和愈合[13]、抗菌[14]的關(guān)鍵作用因子。方格星蟲蛋白質(zhì)酶解液的主要研究集中在抗氧化活性方面，其在骨質(zhì)疏松方面的研究鮮有報道。

骨質(zhì)疏松癥在傳統(tǒng)中醫(yī)上，屬“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”等范疇[15]，是老年人常見的退行性疾病[16]，其病因主要與腎精不足、骨枯而髓減、骨失滋養(yǎng)有關(guān)[17]。中醫(yī)典籍中指出，“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也。髓者腎精所生，精足則髓充，髓充者則骨強”[18]。因此，從傳統(tǒng)補腎壯陽、填精壯骨和強筋健骨的海洋中藥中尋找治療骨質(zhì)疏松藥物[19]，是行之有效的辦法。方格星蟲是《海洋本草》中記載的滋陰補腎良藥[20]，在民間的應(yīng)用由來己久，故從其中的小分子肽中篩選具有促骨生長活性的物質(zhì)成分，可為開發(fā)抗骨質(zhì)疏松藥物奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實驗為從方格星蟲中分離和篩選可促進骨形成的生物活性低聚肽，通過酶解法和膜分離法制備寡肽，并通過HPLC-MS/MS鑒定肽段序列；通過在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測藥物形成，并通過斑馬魚模型評估促進骨形成的作用，以期為方格星蟲的應(yīng)用和開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

方格星蟲（直徑（6±2）mm、長（9±2）cm） 湛江市東風(fēng)批發(fā)市場；斑馬魚 重量2.5~3.0 g，體長2.5~2.8 cm，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院斑馬魚平臺；鈣黃綠素、98.0%甲酸FA、二硫蘇糖醇DTT、碘乙酰胺IAA（≥99%） 美國Sigma-Aldrich公司；4%多聚甲醛 北京雷根生物技術(shù)有限公司；75%乙醇 山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司；三卡因 美國Fluka公司；羧甲基纖維素 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（>4000 U/g) 美國Promega公司；乙腈ACN（≥99.9%） Fisher Chemical；純度>95%的八個多肽 北京百泰派克生物科技有限公司。

1900614S冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；IX3-ZDC2轉(zhuǎn)盤超分辨率共聚焦顯微鏡奧林巴斯；DK8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；CR-22N低溫高速離心機 日本日立公司；LRH-150F生化培養(yǎng)箱 河南儀器設(shè)備有限公司；絞肉機 鎮(zhèn)江睿核；Ultimate 3000毛細管高效液相色譜儀、電噴霧-組合型離子阱 Orbitrap質(zhì)譜儀（Q Exactive? Hybrid Quadrupole-O Mass Spectrome）Thermo Fisher Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 方格星蟲多肽的制備 將冷凍星蟲化凍，沖洗，瀝干水分，稱重后絞碎。按星蟲重量10倍加入純水，混勻，將酶粉漿緩慢加入星蟲液中，邊加邊攪拌混勻，設(shè)置一定的反應(yīng)溫度，攪拌酶解4 h；酶解期間，每小時取樣，8000 r/min離心5 min，取上清液測定540 nm波長處的吸光值，記錄吸光度數(shù)值。吸光度升高至0.32時，結(jié)束酶解。酶解完畢升溫至95 ℃保溫5 min殺酶；使用低溫高速離心機進行離心處理，10000 r/min離心10 min，固液分離。往殘渣中加入200 mL稀鹽酸（pH2.0）混勻，離心棄上清，重復(fù)3次，洗去可溶性蛋白。經(jīng)清洗的沉淀加100 mL水懸浮，懸浮液加95%乙醇230 mL（乙醇終濃度70%）懸浮沉淀，攪勻，8000 r/min離心棄上清。所得沉淀物70 ℃熱風(fēng)干燥為粗多糖。將離心的上清液進行分級層析，依次通過1、200 kDa的超（納）濾膜，截取1~200 kDa的樣液，冷凍干燥獲得樣品。

1.2.2 方格星蟲酶解短肽LC-MS/MS分析鑒定

1.2.2.1 還原烷基化預(yù)處理 用ddH2O溶解短肽，取10 μg短肽加入ddH2O至100 μL，加入二硫蘇糖醇（DTT）溶液使其終濃度為10 mmol/L，于56 ℃水浴中還原1 h；加入碘乙酰胺（IAA）溶液使其終濃度為50 mmol/L，避光反應(yīng)40 min，使用C18脫鹽柱脫鹽，于45 ℃真空離心濃縮儀中揮干溶劑。

1.2.2.2 多肽的酶解 用ddH2O溶解短肽，取10 μg蛋白樣本加入50 mmol/L NH4HCO3溶液至100 μL，加入DTT溶液使其終濃度為10 mmol/L，于56 ℃水浴中還原1 h。加入IAA溶液使其終濃度為50 mmol/L，避光反應(yīng)40 min；按照胰蛋白酶與底物質(zhì)量比為 1:100加入胰蛋白酶，37 ℃酶切4 h，繼續(xù)按質(zhì)量比1:100加入胰酶，37 ℃酶切反應(yīng)過夜（16 h）；酶切后肽段使用C18脫鹽柱脫鹽，于45 ℃真空離心濃縮儀中揮干溶劑。

1.2.3 活性篩選 生物活性的篩選：采用Peptide-Ranker評分（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）；生物穿透概率的測定：采用CPPpred程序（http://distilldeep.ucd.ie/CPPpred/）；水 溶 性 評 定:采 用Innovagen網(wǎng) 站（http://www.innovagen.com/proteomics-tools）；輸入氨基酸序列，默認參數(shù)進行分析。

1.2.4 斑馬魚骨發(fā)育模型

1.2.4.1 斑馬魚飼養(yǎng) 以野生型的斑馬魚為材料，選取四條雌魚和四條雄魚。AB系斑馬魚的胚胎來自野生型AB系斑馬魚的自然交配和產(chǎn)卵。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，AB品系的胚胎和幼蟲在胚胎水（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.4 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L MgSO4和10 ppm亞甲基藍）胚胎水中飼養(yǎng)[21]。繁殖水溫為（28±0.5）℃，pH為7~7.2，黑暗/光照周期為10 h/14 h。

1.2.4.2 給藥方法 斑馬魚與人類基因有高達87%的同源性[22]，所以經(jīng)常作為藥物的高通量篩選模型[23]。將受精3 d以后的野生型斑馬魚幼魚放入盛有胚胎培養(yǎng)基的24孔板中，每組放入20條幼魚，通過前期的毒性試驗和濃度的篩選，最后將其分組為空白對照組（胚胎水）、3個濃度的方格星蟲低聚肽溶液組（50、5、1 μg/mL）。由于方格星蟲提取物溶于水，可直接用胚胎培養(yǎng)基配制藥物。從AB型斑馬魚幼魚受精后第3 d開始加藥[24]，每個孔加入2 mL體積的藥物。每次加完藥后，將24孔板放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度調(diào)節(jié)至28 ℃，加藥培養(yǎng)至9 dpf[25]，9 d后，用羧甲基纖維素對AB型斑馬魚幼魚進行固定，用鈣黃綠素進行染色[26]。

1.2.4.3 鈣黃綠素染色 骨礦化基質(zhì)沉積是骨形成的重要指標(biāo)[27]，采用鈣黃綠素染色進行評估。鈣黃綠素是一種活體染料，是檢測斑馬魚骨發(fā)育的有效熒光染料。斑馬魚胚胎在0.2%鈣黃綠素溶液中浸泡15 min，然后用胚胎水沖洗3次，每次10 min[28]。染色以后用三卡因進行麻醉，羧甲基纖維素進行固定，在共聚焦下采集熒光圖像。然后在共聚焦上進行成像。熒光圖像激發(fā)波長為488 nm，共聚焦設(shè)置同一曝光時間，曝光強度，同一固定換算參數(shù)。所有圖像都是在相同的條件下進行采集。將熒光圖像轉(zhuǎn)換為灰度圖像，并將熒光強度轉(zhuǎn)換為灰度值。將灰度范圍設(shè)置為包括所有灰度局部化，并計算該灰度局部化的面積和密度。

1.2.5 液相質(zhì)譜色譜聯(lián)用 將質(zhì)譜與HPLC聯(lián)用，能夠檢測出HPLC分離出的每一肽段的分子量，將其與理論上所得肽段的分子量比較，就能確定HPLC上每一肽段的峰代表了蛋白質(zhì)的哪一段，從而得到完整而精確可靠的質(zhì)量肽譜結(jié)果。由于串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）具有測序功能，所以在一定范圍內(nèi)能進行肽的一級結(jié)構(gòu)分析，并且在酶解肽段一級結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上完成完整蛋白質(zhì)或者多肽的一級結(jié)構(gòu)分析。

1.2.5.1 毛細管液相色譜條件 預(yù)柱：C18（300 μm i.d.×5 mm，5 μm，100 ?）；分析柱：C18（150 μm i.d. ×150 mm，1.9 μm，100 ?）；流動相 A：0. 1% 甲酸，2%流動相 B：0.1% 甲酸，80% 乙腈；流速：600 nL/min；梯度洗脫條件：0~8 min，6% B；8~24 min，9% B；24~60 min，14% B；60~75 min，30% B；75~78 min，40% B；78 min，95% B。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件 一級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率設(shè)置：70000 @ m/z；MS1 AGC：3e6；Maximum IT：40 ms；離子掃描范圍：300~1600 m/z。

二級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率設(shè)置：17500；MS2 AGC：1e5；Maximum IT：60 ms；Top N：20；NCE/stepped NCE：27。

1.3 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜原始文件使用 Maxquant（1.6.2.10）分別檢索目標(biāo)蛋白數(shù)據(jù)庫；采用Image-Pro Plus 6.0版對圖像進行分析，并對鈣黃綠素染色面積和積分光密度進行定量分析。使用Graphpad 6.0對數(shù)據(jù)進行整理。每組分析20條斑馬魚幼魚。每組實驗重復(fù)進行三次。組間比較采用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計軟件上的student t檢驗進行。P<0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。P<0.001時，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 方格星蟲酶解短肽LC-MS/MS分析鑒定結(jié)果

總離子流色譜圖如圖1所示，從圖1中可以看出整個色譜梯度內(nèi)，色譜峰眾多，分布均勻，顯示色譜分離效果較高。

圖1 LC-MS/MS分析方格星蟲短肽中總離子流色譜圖Fig.1 LC-MS/MS analysis of total ion current chromatogram in short peptides of square siphon worm

2.2 基于在線數(shù)據(jù)庫的活性肽篩選

從表1中可以篩選出肽段的長度在9個氨基酸以內(nèi)的有Phe-Pro-Ser-Leu-Val-Gly-Arg-Pro（FPSLVGPR）；Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg（GFAGDDAPR）；Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Ser-Pro-Glu-Lys（GLGGLSPEK）；Leu-Thr-Glu-Ala-Pro-leu-Asn-Pro-Lys（LTEAPLNPK）；Pro-Ala-Val-Lys-Lys-Pro-Ala-Pro（PAVKKPAP）；Ser-Ile-Leu-Ser-Pro-Ser-Pro-Arg（SILSPSPR）；The -Glu -Ala -Pro -Leu -Asn -Pro -Lys（TEAPLNPK）； Val -Ala -Pro -Glu -Glu -His -Pro -Val（VAPEEHPV）；Val -Val -Thr -Thr -Pro -Lys -Ser -Gly（VVTTPKSG）。利用在線數(shù)據(jù)庫對鑒定到的10個肽進行活性概率、細胞穿透概率、水溶性進行分析，基于后續(xù)實驗對肽水溶性要求，從表2中可篩選出水溶性良好8個肽GFAGDDAPR、GLGGLSPEK、LTEAPLNPK、PAVKKPAP、SILSPSPR、TEAPLNPK、VAPEEHPV、VVTTPKSG。

表1 方格星蟲酶解短肽的LC-MS/MS相對定量結(jié)果Table 1 LC-MS/MS relative quantitative results of enzymatic hydrolysis of short peptides hydrolyzed by squares siphon worm

表2 方格星蟲酶解短肽篩選結(jié)果Table 2 Screening results of short peptides hydrolyzed by squares siphon worm

2.3 低聚肽的促骨發(fā)育作用

由北京百泰派克生物科技有限公司合成純度>95%的八個多肽，通過斑馬魚模型的毒性實驗和促骨發(fā)育活性的篩選，篩選出兩個有促骨發(fā)育活性的低聚肽。這兩個低聚肽分別為GFAGDDAPR、GLGGLSPEK，分別命名為GSP1、GSP2。

2.3.1 GSP1促進斑馬魚的骨發(fā)育作用 與空白對照組相比，1~50 μg/mL GSP1溶液濃度處理的AB斑馬魚幼魚顱骨積分光密度和綠色熒光的面積均有所增加，在5 μg/mL時，GSP1促進斑馬魚骨發(fā)育的效果最好（圖2）。這些結(jié)果表明，GSP1可引起斑馬魚幼體礦化基質(zhì)增加。

圖2 斑馬魚的鈣黃綠素?zé)晒馊玖先旧Y(jié)果和統(tǒng)計分析（10×）Fig.2 Results of zebrafish stained with calcein fluorescent dye and statistical analysis（10×）

2.3.2 GSP2促進斑馬魚的骨發(fā)育作用 與空白對照組相比，1~50 μg/mL GSP2溶液濃度處理的AB型斑馬魚幼魚顱骨積分光密度和綠色熒光的面積均有所增加，且隨著濃度的增加而增大，GSP1濃度在50 μg/mL時促進骨發(fā)育的效果最好（圖3）。這些結(jié)果表明，GSP2可引起斑馬魚幼體礦化基質(zhì)增加。

圖3 斑馬魚的鈣黃綠素?zé)晒馊玖先旧Y(jié)果和統(tǒng)計分析（10×）Fig.3 GSP2 concentration group of zebrafish stained with calcein fluorescent dye and statistic analysis（10×）

由結(jié)果可見，與空白對照相比較，方格星蟲低聚肽GSP1濃度為5 μg/mL時，斑馬魚頭骨IOD與染色面積值有極顯著性差異（P<0.001）；GSP2濃度為50 μg/mL時，斑馬魚頭骨IOD與染色面積值差異性最大（P<0.001）。結(jié)果表明，低聚肽GSP1和GSP2均對斑馬魚的骨發(fā)育有促進作用。

2.4 兩個低聚肽的結(jié)構(gòu)分析

結(jié)果如圖4~圖7所示。由圖4和圖6可知，多肽GSP1氨基酸序列為GFAGDDAPR，分子結(jié)構(gòu)為C38H56N12O14，純度>97%，分子質(zhì)量為905.04 Da。圖5和圖7中，方格星蟲提取物多肽GSP2氨基酸序列為GLGGLSPEK，分子結(jié)構(gòu)為C37H64N10O13，純度>97%，分子質(zhì)量為857.06 Da。

圖4 方格星蟲提取物多肽GSP1的高效液相色譜圖和結(jié)構(gòu)式Fig.4 High performance liquid chromatography and structural formula of square siphon worm polypeptide GSP1

圖5 方格星蟲提取物多肽GSP2的高效液相色譜圖和結(jié)構(gòu)式Fig.5 High performance liquid chromatography and structural formula of square siphon worm polypeptide GSP2

圖6 GSP1質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrum of GSP1

圖7 GSP2質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrum of GSP2

3 結(jié)論與討論

本研究通過酶解法和膜分離制備低聚肽，并通過HPLC-MS/MS鑒定肽段序列。通過斑馬魚模型篩選促骨發(fā)育活性的低聚肽。本實驗在大量前期研究基礎(chǔ)上，探索總結(jié)一套酶解工藝及生產(chǎn)流程，截取1~200 kDa片段樣液，獲得具備最佳活性的方格星蟲低聚肽生產(chǎn)工藝。采用LC-MS/MS分析鑒定方格星蟲低聚肽，得到10個低聚肽；通過斑馬魚模型對低聚肽的促骨發(fā)育活性進行篩選，篩選出兩個低聚肽GFAGDDAPR、GLGGLSPEK。通過斑馬魚模型對其促骨活性濃度篩選，低聚肽GSP1在濃度為5 μg/mL時對斑馬魚骨發(fā)育促進作用最為明顯，低聚肽GSP2在濃度為50 μg/mL時對斑馬魚骨發(fā)育促進作用最明顯。結(jié)果表明，低聚肽GSP1和GSP2明顯促進了斑馬魚的骨發(fā)育。骨質(zhì)疏松癥一直是中老年人的高發(fā)疾病[29]，為老年人生活帶來諸多不便，嚴(yán)重降低發(fā)病人群的生活質(zhì)量[30]。方格星蟲低聚肽的骨活性篩選為骨質(zhì)疏松的治療與預(yù)后提供了方向。