提取方法對銀杏蛋白功能特性及抗氧化活性的影響

李詩穎，陳 琳，糜心怡，梁一凡，李 闖，鄭 義,2,

（1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇徐州 221018；2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇徐州 221018）

銀杏（Ginkgo biloba）為銀杏科銀杏屬植物，是我國特有的中生代孑遺樹種。銀杏種仁（白果）為衛(wèi)計委認(rèn)定的藥食同源物質(zhì)，具有益氣、潤肺和定喘等功能。銀杏營養(yǎng)成分豐富，干制品中蛋白含量13.2%，碳水化合物含量72.6%，粗脂肪含量1.3%，此外還含有豐富的維生素E及多種礦質(zhì)元素[1]。銀杏蛋白以清蛋白和球蛋白為主，氨基酸組成合理，必需氨基酸占比高，屬于優(yōu)質(zhì)植物蛋白[2]。鄧乾春等研究表明，銀杏白蛋白具有較好的清除超氧陰離子和拮抗DNA氧化損傷的活性[3]，銀杏清蛋白可通過免疫調(diào)節(jié)和抗氧化能力發(fā)揮對衰老小鼠、免疫抑制小鼠和S180腫瘤小鼠的保護作用[4?6]。

植物蛋白的提取有物理壓榨和溶劑浸提法等，其中溶劑浸提法是最常使用的方法。溶劑浸提法主要有水提酸沉法（water extraction and acid precipitation,WEAP）、堿提酸沉法（alkali extraction and acid precipitation, AEAP）和鹽提鹽析法，以及各種輔助提取技術(shù)，如超聲輔助提取、微波輔助提取、酶輔助提取、反膠團萃取和雙水相萃取等。目前已有數(shù)篇關(guān)于銀杏蛋白提取工藝的研究報道，李盼盼等優(yōu)化了銀杏蛋白超聲輔助提取的工藝參數(shù)[7]，賈韶千等報道了銀杏蛋白堿法提取的最佳工藝[8]，陳西娟考察了銀杏蛋白的鹽提鹽析法的工藝條件[9]。研究表明功能活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物活性會受到提取方法的影響[10?12]。彭倩等發(fā)現(xiàn)堿提酸沉法和鹽溶法提取的腰果蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性具有顯著性差異[13]。職士淇等研究表明超聲輔助堿提、鹽提和水提制備的青葉苧麻葉蛋白質(zhì)的功能特性各有優(yōu)劣[14]。有關(guān)提取方法對銀杏蛋白功能特性和抗氧化活性的研究未見報道。

本研究采用WEAP、AEAP和超聲輔助堿提酸沉法（ultrasound-assisted alkali extraction and acid precipitation, UA-AEAP）三種方法制備銀杏蛋白，考察提取方法對銀杏蛋白溶解度、起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性等功能特性的影響，同時考察提取方法對銀杏蛋白螯合亞鐵離子能力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH）自由基能力和清除羥基自由基能力的影響，旨在為銀杏蛋白資源的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮銀杏 2020年10月采自江蘇邳州；牛血清白蛋白、DPPH、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate, SDS）、菲啰嗪 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

FA2104N電子分析天平、723C可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司；LGJ-18A冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-D（Ш)循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 新鮮銀杏去外種皮、脫殼后，60 ℃下烘干至恒重，粉碎過60目，加入4倍體積石油醚，浸泡24 h脫脂，得到脫脂銀杏粉。

1.2.2 銀杏蛋白的制備 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定了不同提取方法的工藝參數(shù)。WEAP提取條件：取50 g脫脂銀杏粉，按液料比20:1 mL/g分別加入去離子水，提取溫度60 ℃，提取時間2 h。AEAP提取條件：按液料比20:1 mL/g將脫脂銀杏粉與NaOH溶液混合，調(diào)pH10.0，提取溫度60 ℃，提取時間2 h。UA-AEAP工藝參數(shù)：液料比20:1 mL/g，超聲功率200 W，超聲處理時間20 min，提取溫度60 ℃，提取時間40 min。提取后，3500 r/min離心20 min，收集上清液，調(diào)pH至銀杏蛋白的等電點4.4，4500 r/min離心20 min，所得沉淀透析（截留相對分子質(zhì)量3500 Da）72 h，濃縮，冷凍干燥，得銀杏蛋白。

1.2.3 銀杏蛋白得率及其化學(xué)成分的測定 蛋白含量的測定：GB 50095-2016凱氏定氮法；總糖含量的測定：苯酚硫酸法；粗脂肪含量的測定[15]：5009.6-2016索氏抽提法；灰分含量的測定：GB 5009.4-2016重量分析法。

銀杏蛋白得率計算公式如下：

1.2.4 銀杏蛋白溶解度的測定 將100 mg銀杏蛋白溶于20 mL去離子水中，調(diào)pH為2~12，室溫下攪拌30 min，4500 r/min離心20 min，收集上清液?？捡R斯亮藍(lán)法測定上清液中銀杏蛋白的含量。

1.2.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定 取500 mg銀杏蛋白分散于15 mL 0.01 mol·L?1磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）中，記錄初始體積為V1（mL），10000 r/min均質(zhì)2 min，記錄泡沫體積為V2（mL），靜置30 min記錄體積記為V3（mL）。銀杏蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的計算公式如下：

1.2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 取200 mg銀杏蛋白分散于20 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）中，室溫下攪拌30 min，加入5 mL大豆油，10000 r/min均質(zhì)2 min。吸取100 μL乳液，加入5 mL SDS，混勻，測定500 nm處的吸光度。銀杏蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的計算公式如下：

式中：N為稀釋倍數(shù)；A1和A2分別為0和30 min時的吸光度；c為蛋白濃度，g/mL；θ為乳液中油相體積分?jǐn)?shù)；Δt為兩次吸光度測定的間隔時間，min。

1.2.7 亞鐵離子螯合能力測定 采用Decker報道的方法[16]，并稍加修改。將1 mL銀杏蛋白溶液（0.01~10 g/L）與3.7 mL 55%（v/v)乙醇、0.1 mL氯化亞鐵（2 mmol/L）和0.2 mL菲啰嗪（5 mmol/L）混勻，靜置20 min，測定562 nm處的吸光度。55%乙醇代替樣液作為空白對照。EDTA（0.01~10 g/L）作為陽性對照。亞鐵離子螯合率計算公式如下：

式中：Ab和As分別為空白對照組和樣品組的吸光度。

1.2.8 DPPH自由基清除能力測定 參考Wu等報道的方法[17]。取1.5 mL銀杏蛋白溶液（0.1~6 g/L），加入1.5 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L），混勻，室溫下置于暗處30 min，測定517 nm處的吸光度?？箟难幔?.05~4 g/L）做陽性對照。

式中：Ac為1.5 mL蒸餾水與1.5 mL DPPH混合液的吸光度；As為1.5 mL樣液與1.5 mL DPPH混合液的吸光度；Ab為1.5 mL樣液與1.5 mL 95%乙醇混合液的吸光度。

1.2.9 羥基自由基清除能力測定 采用鄰菲羅啉分光光度法[18]。銀杏蛋白質(zhì)量濃度為0.1~10 g/L，抗壞血酸（0.1~10 g/L）做陽性對照，測定536 nm處的吸光度。損傷組：取0.5 mL鄰菲羅啉（0.75 mmol/L），加入1 mL磷酸鹽緩沖液（0.15 mmol/L，pH7.4）和0.5 mL去離子水，混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L FeSO4，0.5 mL 0.01% H2O2，37 ℃水浴60 min，測吸光度記為Ad。未損傷組：以0.5 mL去離子水代替0.01% H2O2，其他條件同損傷組，測吸光度記為Au。樣品組：以0.5 mL樣液代替0.5 mL去離子水，其他條件同損傷組，測吸光度記為As。樣品參比組：以0.5 mL去離子水代替0.5 mL鄰菲羅啉，其他條件同樣品組，測吸光度記為Ar。空白參比組：以0.5 mL去離子水代替0.5 mL樣液，其他條件同樣品參比組，測吸光度記為Ab。

式中：Ab、Ad、Ar、As和Au分別為空白對照組、損傷組、樣品參比、樣品組和未損傷組的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行方差分析，組間多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 對銀杏蛋白得率和蛋白制品中化學(xué)成分的影響

表1 為提取方法對銀杏蛋白得率和蛋白制品中化學(xué)成分的影響。由表1可知，不同提取方法制備的銀杏蛋白得率存在顯著性差異（P<0.05），其中UA-AEAP蛋白得率最高，達(dá)到了11.36%±0.10%。不同提取方法制備的銀杏蛋白產(chǎn)品中蛋白、總糖、粗脂肪和灰分含量均無顯著性差異（P>0.05）。三種方法制備的銀杏蛋白純度均可以滿足功能特性分析的需要。UA-AEAP蛋白得率高，提取時間短，更加適用于銀杏蛋白的制備。

表1 提取方法對銀杏蛋白得率和蛋白產(chǎn)品中化學(xué)成分的影響Table 1 Effects of extraction methods on the yield of Ginkgo biloba proteins and the chemical components in the products

2.2 對銀杏蛋白溶解度的影響

溶解度是蛋白質(zhì)的重要功能特性之一，乳化性、起泡性、起泡穩(wěn)定性等其他功能特性與溶解度密切相關(guān)[19]。圖1為不同提取方法對不同pH下銀杏蛋白溶解度的影響。由圖1可知，隨著pH的增大，三種提取方法制備的銀杏蛋白的溶解度均先降低后升高，溶解度在pH4.0左右都達(dá)到了最小值，這與李向陽等[20]報道的銀杏蛋白在等電點處的溶解度最低相一致。在pH2~12的范圍內(nèi)，UA-AEAP銀杏蛋白的溶解度最高，WEAP蛋白的溶解度略高于AEAP蛋白。結(jié)果提示，超聲處理可提高銀杏蛋白的溶解度，可能的原因是超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)可以降低蛋白質(zhì)顆粒聚集體的粒度。這與前人研究結(jié)果一致，超聲處理可顯著提高大豆親脂蛋白[21]、鷹嘴豆分離蛋白[22]和Oleosin蛋白[23]的溶解度。

圖1 提取方法對不同pH下銀杏蛋白溶解度的影響Fig.1 Effects of extraction methods on the solubility of Ginkgo biloba proteins at different pH

2.3 對銀杏蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

起泡性和泡沫穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)應(yīng)用于食品加工中最重要的功能特性之一，前者主要取決于蛋白質(zhì)溶液的溶解度、疏水基團的數(shù)目和肽鏈的柔韌性等因素，而后者主要取決于蛋白質(zhì)溶液的流變學(xué)性質(zhì)[24]。圖2為不同提取方法對銀杏蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響。由圖2可知，UA-AEAP蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性顯著高于AEAP蛋白和WEAP蛋白（P<0.05），可能的原因是超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)降低了銀杏蛋白顆粒聚集體的粒度，同時降低水的界面張力，有利于蛋白分子的快速擴散[25]。AEAP蛋白的起泡性顯著低于WEAP蛋白，但泡沫穩(wěn)定性顯著高于WEAP蛋白（P<0.05），可能的原因是水提法溶液的pH更接近蛋白的等電點，被吸附到界面上的蛋白數(shù)量增加，從而提高了蛋白的起泡性[26]。

圖2 提取方法對銀杏蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of extraction methods on the foaming capacity and foam stability of Ginkgo biloba proteins

2.4 對銀杏蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)的乳化性能在食品加工中具有重要的意義，主要受到疏水基因的數(shù)目、界面張力等因素影響。圖3為提取方法對銀杏蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響。由圖3可知，UA-AEAP蛋白的乳化性顯著高于AEAP蛋白和WEAP蛋白（P<0.05），可能的原因是超聲處理增加了銀杏蛋白的溶解度，抑制蛋白聚集，提高乳液界面吸附蛋白能力[25]。WEAP蛋白的乳化性顯著高于AEAP蛋白（P<0.05），可能是因為WEAP蛋白具有更高的溶解度。三種銀杏蛋白的乳化穩(wěn)定性無顯著性差異（P>0.05）。

圖3 提取方法對銀杏蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of extraction methods on the emulsifying capacity and emulsion stability of Ginkgo biloba proteins

2.5 對銀杏蛋白螯合亞鐵離子能力的影響

亞鐵離子等過渡態(tài)金屬離子可催化機體中的Fenton反應(yīng)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化并產(chǎn)生羥基自由基，螯合亞鐵離子能力是評估受試物抗氧化活性的常用方法之一[27]。不同提取方法對銀杏蛋白螯合亞鐵離子能力的影響如圖4所示。三種銀杏蛋白均表現(xiàn)出較好的亞鐵離子螯合能力，且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在質(zhì)量濃度為2.0 g/L時，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對亞鐵離子的螯合率分別為21.78%±0.78%、12.92%±0.46%和18.78%±0.58%，而質(zhì)量濃度增加至8.0 g/L時，螯合率分別提高到68.54%±3.01%、67.68%±3.21%和73.28%±3.45%。在低質(zhì)量濃度時，三種銀杏蛋白對亞鐵離子螯合能力的順序為WEAP>UA-AEAP>AEAP；而當(dāng)質(zhì)量濃度超過3.0 g/L時，UA-AEAP的螯合能力則高于WEAP和AEAP。銀杏蛋白對亞鐵離子的螯合能力可能是因為氨基酸殘基中的羧基等基團與亞鐵離子發(fā)生了配位反應(yīng)。UA-AEAP蛋白具有更強的亞鐵離子螯合能力，可能是因為超聲處理能夠降低銀杏蛋白聚集體的粒度，暴露出更多功能基團[28]。許晶等研究表明，超聲預(yù)處理也可顯著提高大豆蛋白對亞鐵離子的螯合能力[29]。

圖4 提取方法對銀杏蛋白螯合鐵離子能力的影響Fig.4 Effects of extraction methods on the chelating ability against ferrous ions of Ginkgo biloba proteins

某種受試物的IC50低于10 g/L，則說明該受試物具有一定的抗氧化能力[30]。利用Origin 2018對圖4數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性曲線擬合，得到WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對DPPH自由基清除能力的對數(shù)曲線方程分別為y=?31.56+43.32 ln（x+0.1.63），R2=0.9735，y=?57.88+53.008 ln（x+2.15），R2=0.9719和y=?16.92+41.33 ln（x+0.73），R2=0.9662。根據(jù)R2可知，擬合優(yōu)度較好，由上述方程計算得出WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對亞鐵離子螯合能力的IC50分別為4.94、5.48和4.32 g/L。由IC50可知，三種銀杏蛋白對亞鐵離子的螯合能力順序為UAAEAP>WEAP>AEAP。陽性對照的IC50為0.09 g/L，提示EDTA具有極強的螯合亞鐵離子的能力。

2.6 對銀杏蛋白清除DPPH自由基能力的影響

DPPH自由基清除能力是評估受試物抗氧化潛力的最常用方法之一，當(dāng)DPPH自由基被受試物清除時，DPPH溶液的吸光度會降低，因此可用于評估受試物的清除自由基能力[31]。不同提取方法對銀杏蛋白清除DPPH自由基能力的影響如圖5所示。在0.05~6 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，三種銀杏蛋白的DPPH自由基清除率均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 g/L時，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對DPPH自由基的清除率分別為42.61%±2.14%、41.63%±3.23%和50.47%±1.95%；當(dāng)質(zhì)量濃度升高至為5 g/L時，清除率分別提高到70.45%±2.36%、68.78%±2.56%和74.92%±2.28%。與WEAP和AEAP蛋白相比，UA-AEAP蛋白具有更強的DPPH自由基清除能力，可能的原因是超聲處理能降低銀杏蛋白的聚集度，暴露出更多的與自由基作用的基團。Ma等研究表明，超聲處理可提高β-乳球蛋白對DPPH自由基的清除能力[32]，這與本研究的結(jié)果相一致。

圖5 提取方法對銀杏蛋白清除DPPH自由基能力的影響Fig.5 Effects of extraction methods on the DPPH radical scavenging activity of Ginkgo biloba proteins

WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對DPPH自由基清除能力的對數(shù)曲線方程分別為y=37.69+19.31 ln（x+0.11），R2=0.9931，y=34.36+19.86 ln（x+0.15），R2=0.9911和y=45.54+17.79 ln（x+0.04），R2=0.9954。由上述方程計算得出WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對DPPH自由基能力的IC50分別為1.78、2.05和1.24 g/L，表明這三種銀杏蛋白均具有較高的清除DPPH自由基能力，清除能力順序為UAAEAP>WEAP>AEAP。抗壞血酸的IC50為0.08 g/L，提示抗壞血酸具有極強的清除DPPH自由基能力。

2.7 對銀杏蛋白清除羥基自由基能力的影響

羥基自由基被認(rèn)為是目前已知的氧化能力最強和危害性最大的活性氧之一，可通過電子轉(zhuǎn)移、加成和脫氫作用攻擊機體內(nèi)多種生物分子，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)的氧化損傷[33]。圖6為不同提取方法對銀杏蛋白清除羥基自由基能力的影響。由圖可知，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對羥基自由基的清除活性與蛋白質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在質(zhì)量濃度為1.0 g/L時，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對羥基的清除率分別為25.5%±0.82%、22.56%±0.74%和28.62%±1.21%；當(dāng)質(zhì)量濃度增加至8.0 g/L時，清除率分別為73.96%±2.73%、68.52%±2.64%和78.94%±2.95%。由此可知，UA-AEAP蛋白具有更強的羥基自由基清除能力，這與前人研究結(jié)果相一致，大豆球蛋白經(jīng)超聲預(yù)處理后對羥基自由基的清除能力顯著增強[29]。銀杏蛋白對羥基自由基的清除能力可能是因為氨基酸殘基中的羧基等基團通過螯合亞鐵離子而阻斷Fenton反應(yīng)，從而降低羥基自由基的產(chǎn)生。

圖6 提取方法對銀杏蛋白清除羥基自由基能力的影響Fig.6 Effects of extraction methods on thehydroxyl radical scavenging activity of Ginkgo biloba proteins

WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對羥基自由基清除能力的對數(shù)曲線方程分別為y=10.25+28.13 ln（x+0.80），R2=0.9944，y=6.01+27.64 ln（x+0.79），R2=0.9946和y=17.76+27.40 ln（x+0.49）,R2=0.9904，計算出IC50分別為3.31、4.12和2.76 g/L，由此可知，三種銀杏蛋白對羥基自由基清除能力的順序為UA-AEAP>WEAP>AEAP?？箟难岬腎C50為0.80 g/L，表明抗壞血酸具有極強的清除羥基自由基能力。

3 結(jié)論

不同提取方法對銀杏蛋白得率的影響較大，其中UA-AEAP蛋白得率最高，達(dá)11.36%±0.10%，顯著高于WEAP和AEAP。三種提取方法制備的銀杏蛋白純度均較高，可以滿足功能特性分析的需要。銀杏蛋白溶解度受到提取方法的影響，UA-AEAP蛋白的溶解度最高，WEAP蛋白的溶解度略高于AEAP蛋白。提取方法顯著影響了銀杏蛋白的起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化性等功能特性，而對乳化穩(wěn)定性無顯著性影響；UA-AEAP蛋白的起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化性均優(yōu)于AEAP和WEAP蛋白。提取方法影響了銀杏蛋白的抗氧化活性，銀杏蛋白的螯合亞鐵離子能力、清除DPPH自由基能力和清除羥基自由基能力的順序均為：UA-AEAP>WEAP>AEAP。綜上所述，UA-AEAP蛋白得率高、抗氧化能力和功能特性優(yōu)于另外兩種方法，更適于銀杏蛋白的制備。本研究考察了提取方法對銀杏蛋白功能特性及抗氧化活性的影響，為銀杏蛋白在食品體系中的應(yīng)用及功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，后續(xù)將進(jìn)一步研究不同提取方法對銀杏蛋白氨基酸組成、二級結(jié)構(gòu)、亞基組成、分子構(gòu)象等結(jié)構(gòu)的影響。