高溫高壓處理對(duì)花生致敏蛋白Ara h1及其免疫反應(yīng)性的影響

李穎超，趙 良，錢(qián) 和

（1.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇常州 213164；2.江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫 214122）

花生由于其營(yíng)養(yǎng)豐富、口感香濃被泛應(yīng)用于食品加工，然而花生也是世界衛(wèi)生組織公布的8大食物致敏原之一，且其致敏性不同于牛奶、雞蛋等，往往伴隨患者終生[1?4]。目前，國(guó)際公認(rèn)比較有效的方式是避免致敏原的攝入，然而有調(diào)查結(jié)果顯示，高達(dá)75%的消費(fèi)者因?yàn)榕既灰蛩財(cái)z入花生蛋白而造成過(guò)敏[5]。另外，在食物過(guò)敏引起的死亡病例中，過(guò)半由花生引起[6?7]。因此，降低花生中致敏蛋白的含量或其致敏原性，對(duì)于保護(hù)消費(fèi)者免于遭受過(guò)敏性疾病具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

熱加工被普遍應(yīng)用于食品的加工和烹飪過(guò)程，且諸多研究表明，不同的熱加工處理會(huì)顯著影響花生致敏蛋白的特性[8?10]。水煮后花生致敏蛋白免疫反應(yīng)性下降[8?10]，而烘焙和油炸可能會(huì)產(chǎn)生新的抗原表位而導(dǎo)致致敏性增加[9?10]，而高溫高壓處理可顯著降低杏仁的致敏性[11]，在雞蛋[12]、牛奶[13]和蕎麥[14]的研究中也得到類(lèi)似結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)結(jié)果也顯示，高溫高壓處理可顯著降低花生致敏蛋白的免疫反應(yīng)性[15]，但未系統(tǒng)研究。因此，本研究通過(guò)免疫學(xué)方法，相對(duì)系統(tǒng)地研究了不同高溫高壓處理?xiàng)l件下，花生致敏蛋白主要組分Ara h1溶解性和免疫反應(yīng)性的變化規(guī)律，同時(shí)考察了其在粗蛋白提取物的混合體系中上述特性的變化狀況，可更加真實(shí)的反應(yīng)致敏蛋白在實(shí)際加工過(guò)程中的變化，以期為花生脫敏工藝或脫敏產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的基礎(chǔ)研究支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生（魯花1號(hào)，使用前剔除有病蟲(chóng)害和不完整的個(gè)體） 無(wú)錫市區(qū)超市；BSA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒、TMB/DAB顯色液 上海生物工程有限公司；醋酸纖維膜（1.2 μm，德國(guó)Sartorius）、96孔酶標(biāo)板（96孔聚苯乙烯，Costar）、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（美國(guó)Southern Biotech） 上海瑞頂化學(xué)技術(shù)有限公司；4只健康雄性新西蘭大白兔（JN No. 20141111-1215（46）） 蘇州高新區(qū)鎮(zhèn)湖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司；弗氏佐劑（完全和不完全） Sigma公司；BSA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒、TMB/DAB顯色液 上海生物工程有限公司；三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、冰醋酸等 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；Mini-PROTEAN 165-8003電泳儀 美國(guó)BIO-RAD；CHEMI SYSTEM凝膠成像及分析系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；AKTA Purifier蛋白純化系統(tǒng)、Hiprep 16/10 DEAE Fast Flow陰離子交換柱 美國(guó)GE公司；M5酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；Milipore超濾離心管 蘇州麥?zhǔn)锟萍加邢薰尽?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生粗蛋白及Ara h1的制備 挑選新鮮無(wú)蟲(chóng)害的花生米，去除紅衣后，粉碎過(guò)40目篩，得花生粉末（測(cè)水分含量）。將花生粉末與丙酮按1:10（g/mL）混合后，磁力攪拌脫脂2 h，靜置待其沉淀后，棄去上清。重復(fù)脫脂一到兩次。脫脂后的花生粉末在通風(fēng)櫥中放置過(guò)夜，使丙酮充分揮發(fā)。再將脫脂花生粉末與預(yù)先冷卻的浸提液（含0.01 mol/Lβ-巰基乙醇和0.05% EDTA·2Na的0.01 mol/L PBS）按 照1:10（g/mL）混合，4 ℃下磁力攪拌過(guò)夜。浸提液在4 ℃，11000 r/min離心30 min，收集上清得花生蛋白粗提物（PP），測(cè)蛋白含量后分裝保存于?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

上述得到的粗蛋白液分別經(jīng)40%和65%硫酸銨分級(jí)沉淀后，收集的沉淀用適量的PBS溶解[16]。溶解液用50 K的超濾離心管，在4 ℃，11000 r/min，10 min條件下復(fù)溶并離心2次，得到蛋白濃度為5 mg/mL的溶液。該蛋白溶液再經(jīng)DEAE柱分離純化，經(jīng)電泳鑒定獲得目標(biāo)分子量（65 kDa）蛋白液。蛋白液再經(jīng)50 kDa的超濾離心管濃縮并除去氯化鈉，用PBS調(diào)節(jié)蛋白濃度為10 mg/mL，分裝保存于?80 ℃?zhèn)溆?。將純化后的Ara h1進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將目的條帶切下來(lái)，放入裝有無(wú)菌水的已滅菌的AP管內(nèi)，密封后，送至暨南大學(xué)生命與健康工程研究院功能蛋白質(zhì)中心進(jìn)行進(jìn)一步質(zhì)譜鑒定，確認(rèn)其為花生致敏原Ara h1。

1.2.2 兔源多克隆抗體的制備 清潔級(jí)雄性新西蘭大白兔4只，3個(gè)月齡左右，體重約2 kg。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，若試驗(yàn)動(dòng)物無(wú)異常狀況，耳緣靜脈取約2.0 mL血液，分離得到血清后分裝并于?80 ℃保存?zhèn)溆?，即為陰性血清?周后，對(duì)試驗(yàn)用兔進(jìn)行首次免疫（弗氏完全佐劑與700 μg/mL抗原蛋白液等體積混合后充分乳化，頸背部皮下多點(diǎn)注射，劑量為1 mL/只）。第5周，進(jìn)行加強(qiáng)免疫（弗氏不完全佐劑與700 μg/mL抗原蛋白液等體積混合后充分乳化，頸背部皮下多點(diǎn)注射，劑量為1 mL/只）。之后，每隔2周兔腹股溝皮下加強(qiáng)免疫1次，直至產(chǎn)生高效價(jià)的抗體[17?18]。本實(shí)驗(yàn)共加強(qiáng)免疫3次，獲得Ara h1和花生粗蛋白相對(duì)應(yīng)的效價(jià)分別為1:300000和1:160000的抗體血清。

1.2.3 花生蛋白的高溫高壓處理 Ara h1和花生蛋白粗提物（PP）的高溫高壓處理：將濃度10 mg/mL的蛋白液每5~8 mL分裝在玻璃試管中，將試管塞輕輕蓋上，小心插入定性濾紙條以免密封。然后在不同的條件下進(jìn)行高溫高壓處理：分別在121 ℃（0.1 MPa）、135 ℃（0.22 MPa）下處理10、20、30和60 min。處理后，待樣品充分冷卻后，轉(zhuǎn)移至離心管，在10000 r/min離心10 min，上清分裝后?80 ℃保存待用，沉淀冷凍干燥后置于干燥器中保存待用。

1.2.4 可溶性蛋白含量測(cè)定 取樣品上清液并將上清液梯度稀釋后按說(shuō)明書(shū)（BSA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒，考馬斯亮藍(lán)染色法）進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE） 采用不連續(xù)體系SDS-PAGE垂直平板凝膠電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠內(nèi)的電壓為80 V，分離膠內(nèi)的電壓為120 V。電泳后，考馬斯亮藍(lán)R-250染色、甲醇-冰醋酸脫色、凝膠成像得到電泳結(jié)果[19?20]。樣品上清液與上樣緩沖液1:4混合煮沸3~5 min，上樣量為10 μL。低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量為14.4~97.4 kDa。

1.2.6 免疫印跡（Western blotting） a.電泳：SDSPAGE電泳后，凝膠不染色，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡至少5 min。b.轉(zhuǎn)膜（半干法）：NC膜、濾紙和無(wú)紡纖維墊在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20 min，從陰極到陽(yáng)極，依次放置無(wú)紡纖維墊、三層濾紙、凝膠、NC膜、三層濾紙、無(wú)紡纖維墊，制作“三明治”電轉(zhuǎn)芯，期間用玻璃棒趕走氣泡，將其放入轉(zhuǎn)印槽，200 mA轉(zhuǎn)膜70 min。c.封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，37 ℃下TBS漂洗3次，每次5 min。漂洗后，加入封閉液，4 ℃過(guò)夜。d.加一抗：TBST漂洗3次，每次5 min。加入一抗（1:100，抗體血清——兔抗PE或Ara h1），在37 ℃孵育3 h。e.加二抗：TBST漂洗3次，每次5 min，加入二抗（1:2500，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG）37 ℃孵育2 h；f.顯色以及終止：TBST漂洗5次，每次5 min，再用TBS漂洗3次，每次5 min。加入DAB顯色液，37 ℃染色5 min后，立即拿出NC膜，用蒸餾水漂洗，以終止顯色。采集照片后，避光晾干保存[19?20]。

1.2.7 間接竟?fàn)嶦LISA 1 μg/mL的PE或2.5 μg/mL的Ara h1在4 ℃下包被過(guò)夜，洗滌后加入一抗（1:2500兔抗PE，1:30000兔抗Ara h1）與待測(cè)樣品液（稀釋5倍）的混合物（1:1），37 ℃孵育1 h。再次洗滌3次，加入二抗（1:5000，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG）37 ℃孵育1 h。再洗滌4次后，加入TMB顯色液，37 ℃孵育0.5 h。之后加入1 mol/L的硫酸溶液終止反應(yīng)，37 ℃孵育15 min后立即在450 nm下測(cè)定吸光度值[19?20]。抑制率（%）=（1?A樣/A0）×100，式中：A樣是樣品的吸光度值；A0是只有一抗的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003進(jìn)行均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)Doucan’s多重檢驗(yàn)（P<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 高溫高壓處理后樣品中可溶性蛋白含量的變化

Ara h1和PP在高溫高壓處理后，樣品溶液中蛋白的含量的變化呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。在121和135 ℃處理?xiàng)l件下Ara h1隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白含量均呈下降趨勢(shì)；135 ℃、20 min時(shí)樣品中可溶性蛋白含量為對(duì)照的64%，20 min后不再隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，且20、30和60 min處理間無(wú)顯著差異（圖1A）。而PP在前10 min呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且明顯低于對(duì)照，后由隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升的趨勢(shì)，且135 ℃、60 min處理的樣品與對(duì)照無(wú)顯著差異（圖1B）。由以上結(jié)果可知，高溫高壓處理對(duì)Ara h1溶解性的影響有限，無(wú)論是121或是135℃處理20 min后，樣品中蛋白含量不再變化，其中存在熱穩(wěn)定性極好蛋白片段。而花生蛋白粗提物則不同，在高溫高壓短時(shí)間處理后，蛋白變性發(fā)生聚集，溶液中蛋白含量急劇下降；后來(lái)隨時(shí)間延長(zhǎng)，又快速上升，這提示大部分蛋白在高溫高壓的作用下又再次變得可溶，這也許是在極端條件下蛋白發(fā)生了降解。一般情況下，蛋白質(zhì)在70~80 ℃下會(huì)造成二級(jí)結(jié)構(gòu)的喪失和重構(gòu)，80~90 ℃下二硫鍵斷裂重組，90~100 ℃下形成聚集體[21?22]。Zhang等在研究傳統(tǒng)熱處理和高溫高溫處理對(duì)雞蛋中主要的致敏蛋白卵鐵傳遞蛋白（OVT）和卵類(lèi)粘蛋白（OVM）的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)濕熱滅菌條件（121 ℃，10 min）下可顯著摧毀OVM的一級(jí)結(jié)構(gòu)[12]。

圖1 高溫高壓處理后Ara h1（A）和花生蛋白粗提物（B）樣液中可溶性蛋白質(zhì)含量的變化Fig.1 Soluble protein levels of Ara h1 (A) and peanut protein extracts (B) after autoclaved treatment

PP中前期的急劇下降是由于其中蛋白的熱穩(wěn)定性差，也可能是PP中不同的蛋白間相互作用，使其更容易發(fā)生聚集。但PP中這種可溶性蛋白質(zhì)含量的變化，即10 min時(shí)的快速下降及之后的上升幾乎與Ara h1不相關(guān)，因?yàn)閺膱D1A結(jié)果中可以看出，Ara h1表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。這與Keshavarza等[23]的在魚(yú)致敏蛋白中的研究結(jié)果基本一致。

2.2 高溫高壓處理后樣品中可溶性蛋白電泳圖譜的變化

Ara h1經(jīng)高溫高壓處理后其SDS-PAGE圖譜發(fā)生了顯著變化，65 kDa的完整Ara h1蛋白分子發(fā)生了分解，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，較小分子量的蛋白所占的比例逐步升高。這種趨勢(shì)在135 ℃處理的樣品中表現(xiàn)的更加突出，60 min時(shí)分子量為15 kDa左右的蛋白或更小的蛋白占了較大比例（圖2A）。在花生蛋白粗提物體系中，高溫高壓處理后，完整的65 kDa的Ara h1更易從圖譜中消失，這提示Ara h1在混合體系中更易發(fā)生聚集或分解，熱穩(wěn)定性下降。Cabanillas等的研究結(jié)果也顯示，高溫高壓處理后，花生及經(jīng)過(guò)烘焙、煎炸和水煮的花生樣品的蛋白均發(fā)生了明顯分解[17]。由此可知，高溫高壓處理可使花生蛋白及其主要致敏原Ara h1發(fā)生分解，濕熱滅菌條件（121 ℃，10~20 min）時(shí)65 kDa就已明顯減少，135 ℃處理20 min或更長(zhǎng)時(shí)間后樣品中15 kDa左右或更小分子量的蛋白成為分解物的主要組成部分（圖2B）。

圖2 高溫高壓處理后Ara h1（A）和花生蛋白粗提物（B）樣液的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of Ara h1 (A) and peanut protein extracts (B) after autoclaved treatment

2.3 高溫高壓處理后樣品中可溶性蛋白免疫反應(yīng)性的變化

由圖3A可知，高溫高壓處理可使花生蛋白粗提物混合體系中或純品Ara h1的免疫反應(yīng)性均明顯下降，且135 ℃處理更為明顯。135 ℃處理20和60 min后，純品Ara h1的免疫反應(yīng)性分別僅為對(duì)照的1/3和1/6。同時(shí)，混合體系的環(huán)境中，Ara h1的免疫反應(yīng)性在高溫高壓處理后下降趨勢(shì)更為急劇，同樣135 ℃處理20和60 min后，Ara h1的免疫反應(yīng)性分別僅為對(duì)照的2/9和1/9。但是，需要明確的是，處理后Ara h1的免疫反應(yīng)性的明顯下降與樣品中蛋白含量的下降呈一致趨勢(shì)，且在PP體系中下降速度更快。這說(shuō)明混合體系對(duì)于致敏蛋白的溶解性有顯著影響，進(jìn)而改變其免疫反應(yīng)性。當(dāng)然，高溫高壓處理使得致敏蛋白的免疫反應(yīng)性的下降不能全部歸因于蛋白質(zhì)的不溶解性。圖1A實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ara h1處理組在121或135 ℃下處理20 min及更長(zhǎng)時(shí)間后樣品中可溶性蛋白含量均為對(duì)照的64%，而相同處理?xiàng)l件下（圖3A）Ara h1的免疫反應(yīng)性分別僅為對(duì)照的23%、15%和11%。首先，變化趨勢(shì)存在差異，可溶解性蛋白含量在20 min時(shí)達(dá)到平衡，不再明顯下降；而免疫反應(yīng)性呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。其次，免疫反應(yīng)性的下降更為迅速。根據(jù)以上結(jié)果可以推斷，高溫高壓處理使得花生致敏蛋白Ara h1免疫反應(yīng)性的明顯下降由兩個(gè)因素導(dǎo)致：a. 致敏蛋白可溶解性下降，使得檢測(cè)樣品中蛋白含量減少；b. 樣品中剩余的可溶性蛋白其免疫反應(yīng)性較對(duì)照也明顯減弱，可能是由于親和力較強(qiáng)的蛋白片段變性沉淀，也可能是由于可溶解性片段的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變導(dǎo)致其親和力下降。目前有多項(xiàng)研究也表明，高溫高壓也可顯著降低榛子[24]、綠豆[25]、雞蛋[12]及蕎麥[14]等致敏食物的致敏蛋白的免疫反應(yīng)性，但這種降低同樣與致敏蛋白的變性沉淀導(dǎo)致其可溶性下降密切相關(guān)。Qin等[8]的進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，高溫高壓可降低花生致敏蛋白rAra h 2.02的3個(gè)核心的抗原表位的IgE的結(jié)合能力，并證實(shí)這與rAra h 2.02二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致抗原表位的掩藏相關(guān)。

圖3 高溫高壓處理后Ara h1和花生蛋白粗提物（PP）樣液的ELISA（A）和western blotting（B-Ara h1, C-PP）圖Fig.3 ELISA (A) and western blotting (B-Ara h1,C-PP) of Ara h1 and peanut protein extracts after autoclaved treatment

此外，從圖3B可以看到，121℃處理后，除完整的Ara h1，其分解產(chǎn)生的免疫活性片段主要是分子量為55、35、25和15 kDa左右的蛋白。在混合體系中，121 ℃處理后，Ara h1分解產(chǎn)生的免疫活性片段的分子量主要分布在為35、25和15 kDa左右（圖3C）。這說(shuō)明，在PP體系中Ara h1免疫反應(yīng)性的快速下降與圖3B中分子量在55 kDa左右的蛋白密切相關(guān)。這種較大分子量蛋白片段在混合體系中的消失可是由于其體系中其它蛋白的熱變性、聚集發(fā)生沉淀時(shí)挾裹該較大分子量蛋白沉淀后造成的。Keshavarza等[23]的研究結(jié)果也顯示，混合蛋白體系中，蛋白的質(zhì)的熱穩(wěn)定性的下降更為明顯，主要是由于蛋白間物理（如疏水作用）和化學(xué)（如二硫鍵）作用的結(jié)果。

3 結(jié)論

高溫高壓處理可使Ara h1及花生蛋白粗提物均發(fā)生明顯的變性和分解，濕熱滅菌條件（121 ℃，10~20 min）下已比較明顯，而135 ℃時(shí)則非常明顯。135 ℃處理20 min或更長(zhǎng)時(shí)間后樣品中15 kDa左右或更小分子量的蛋白片段成為分解物的主要組成部分。ELISA結(jié)果顯示，高溫高壓處理可使Ara h1的免疫反應(yīng)性顯著下降，且在蛋白粗提物的混合體系中更為顯著，這與蛋白質(zhì)間相互作用相關(guān)；同時(shí)，盡管Ara h1在135 ℃處理20 min后表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，可溶性蛋白含量不再發(fā)生明顯變化，但其免疫反應(yīng)性卻呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，這表明可溶解性片段的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而導(dǎo)致其免疫親和力下降，從而降低了其免疫反應(yīng)性。