原子力顯微鏡觀察大豆異黃酮類小分子納米形貌及與血小板的相互作用

溫 晶 阿依江 王耀楠 王玉記 趙淑銳*

(1.國家藥品監(jiān)督管理局食品藥品審核查驗中心， 北京 100037；2. 首都醫(yī)科大學藥學院， 北京 100069；3. 首都醫(yī)科大學中心實驗室， 北京 100069)

血小板作為哺乳動物血液中的有形成分之一，其直徑大約1～3微米，體積小，無細胞核，呈雙面微凸的圓盤狀[1]。血小板在止血、傷口愈合、炎癥反應、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理過程中有重要作用[2]。聚集功能是血小板參與止血和血栓形成過程的重要因素之一[3-5]。血小板聚集儀測定血小板是否發(fā)生聚集以及聚集率是目前科研中常用的方法。文獻報道的血小板的形態(tài)的表征大部分都是運用電子顯微鏡來進行測試[6-10]。

原子力顯微鏡(atomic force microscope，簡稱AFM)利用微懸臂感受和放大懸臂上尖細探針與受測樣品原子之間的作用力，從而達到檢測的目的。AFM可以提供真正的三維表面圖，可以在大氣壓狀態(tài)下成像，且樣品制備時間短，不需要對樣品進行任何特殊處理，易操作。原子力顯微鏡不僅可以觀察到血小板的三維形貌，甚至會觀察到藥物與血小板的相互作用[11]。

大豆異黃酮類化合物對心血管疾病具有防治作用[12-14]，具有抗血栓活性并且具有較強的抗氧化作用[15]。三羥基異黃酮-Lys-Lys-PD是課題組依據(jù)拼合原理設計的具有抗血栓活性的化合物[16,17]。本研究利用原子力顯微鏡觀察三羥基異黃酮-Lys-Lys-PD對血小板形態(tài)及功能的影響，對比血小板在藥物作用前后其形態(tài)的變化，為相關藥物的作用機理研究提供一定的依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

AFM測試采用布魯克公司的multimode 8原子力顯微鏡，該儀器處于大氣壓下專用防震隔音平臺上，實驗過程中所選探針型號為布魯克公司的SNL-10，選用硅片作為樣品制備的基底。

1.2 試劑

三羥基異黃酮-Lys-Lys-PD(實驗室自制，圖1)；花生四烯酸購買于美國 Sigma-Aldrich 公司；戊二醛、枸櫞酸鈉購買于北京化學試劑公司。

圖1 三羥基異黃酮-Lys-Lys-PD(實驗室自制)

1.3 實驗動物

雄性SD大鼠，180～220g，購買于北京維通利華動物實驗技術有限公司。

2 實驗內(nèi)容

1)精確稱取1mg三羥基異黃酮-Lys-Lys-PD，加入生理鹽水1mL溶解。超聲分散均勻。并稀釋樣品濃度為5×10-7、5×10-8和5×10-9M，備用。稱取1.5mg花生四烯酸，加入1毫升生理鹽水，配成1.5mg/mL的溶液備用。

2)血小板的采集：采集健康SD大鼠的頸動脈血，按照血液與枸櫞酸鈉的體積比9∶1的比例加入濃度為3.8%的枸櫞酸鈉溶液，血樣于1000 rpm/min離心10分鐘沉淀血細胞，取上清，得到富血小板血漿(PRP)。PRP于3000 rpm/min離心10分鐘，棄去上清后得到血小板固體。加入生理鹽水，用滴管將血小板吹打均勻后，再次于3000 rpm/min離心10分鐘，棄去上清，保留固體。再重復該操作一次，得到未活化的血小板。加入生理鹽水稀釋后進行血小板計數(shù)，調(diào)整血小板濃度為1×105個/mL。

3)取上述400μL血小板懸液8份，第1份加入100μL生理鹽水，孵育30 分鐘(37℃)，得到未活化血小板； 第2份加入50μL花生四烯酸和50μL生理鹽水，孵育30 分鐘(37℃)，得到活化血小板；第3-5份分別加入濃度為5×10-7、5×10-8和5×10-8M 的大豆異黃酮-Lys-Lys-PD溶液和50μL生理鹽水，孵育30 分鐘(37℃)；第6-8份分別加入濃度為5×10-7、5×10-8和5×10-9M 的大豆異黃酮-Lys-Lys-PD溶液和50μL花生四烯酸溶液，孵育30 分鐘(37℃)。吸取所治得的樣品溶液100μL依次滴到樣品碟上，五分鐘后，用濾紙吸掉部分溶液，每個樣品上滴30μL3%戊二醛溶液，固定10分鐘，然后加100μL純水于硅片上，清洗樣品，重復洗滌3次，樣品晾干備用。

4)分別吸取濃度為5×10-8、5×10-9和5×10-10M 的大豆異黃酮-Lys-Lys-PD樣品生理鹽水溶液100μL依次滴到樣品碟上，五分鐘后，用濾紙吸掉部分溶液，然后加100μL純水于硅片上，清洗樣品，重復洗滌3次，樣品晾干備用。

5)將樣品硅片通過雙面膠粘到樣品鐵片上，然后將固定在鐵片上的樣品放入帶有磁性的樣品臺中心，使其吸住鐵片和樣品。 注意調(diào)節(jié)樣品臺高度，以防止安裝Holder時探針直接壓到樣品表面上而損壞探針。將SNL-10探針安裝于探針Holder，將探針Holder置于原子力顯微鏡head上，調(diào)整儀器激光至探針針尖處，并調(diào)整激光反饋值sum使其達到最大值。選定掃描模式為Contact Mode in Air ，掃描參數(shù)Scan Size: 40μm×40μm，Scan Rate: 1Hz，Samples/Line: 512，Date type: Height， Deflection Setpoint: 2V。觀察以上實驗各組樣本的形貌及血小板的形貌變化。

6)配制濃度為5×10-8M的大豆異黃酮-Lys-Lys-PD超純水溶液，取50μL滴到銅網(wǎng)上，晾干，透射電鏡下觀察大豆異黃酮-Lys-Lys-PD在水溶液中的形貌。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

圖1中的各圖分別對應的是A 靜息血小板的原子力顯微鏡形貌； B大豆異黃酮-Lys-Lys-PD (5×10-8M)處理的靜息血小板的原子力顯微鏡形貌； C大豆異黃酮-Lys-Lys-PD (5×10-9M)處理的靜息血小板的原子力顯微鏡形貌； D大豆異黃酮-Lys-Lys-PD (5×10-10M)處理的靜息血小板的原子力顯微鏡形貌；E花生四烯酸活化血小板的原子力顯微鏡形貌; F大豆異黃酮-Lys-Lys-PD (5×10-8M)處理的花生四烯酸活化血小板的原子力顯微鏡形貌； G大豆異黃酮-Lys-Lys-PD (5×10-9M)處理的花生四烯酸活化血小板的原子力顯微鏡形貌； H大豆異黃酮-Lys-Lys-PD (5×10-10M)處理的花生四烯酸活化血小板的原子力顯微鏡形貌。

圖1 大豆異黃酮-Lys-Lys-PD 的納米粒粘附到大鼠血小板表面的原子力顯微鏡形貌

圖1A顯示為單純的靜息的血小板表面光滑沒有偽足。圖1B、1C、1D觀察到5×10-8、5×10-9和5×10-10M 濃度下的大豆異黃酮-Lys-Lys-PD孵育的靜息血小板表面分別存在大量高度為188 nm、134 nm和120 nm的納米顆粒, 沒有觀察到多偽足的血小板，未觀察到血小板聚集現(xiàn)象。圖E顯示為花生四烯酸活化的血小板表面光滑、有偽足且有聚集現(xiàn)象。圖F、G、H可以觀察到濃度為5×10-8、5×10-9和5×10-10M的大豆異黃酮-Lys-Lys-PD孵育的花生四烯酸活化血小板表面分別存在大量高度為188 nm、142 nm和118 nm的納米粒。

粒度大小與濃度為5×10-8M 的大豆異黃酮-Lys-Lys-PD水溶液在透射電鏡中測得的粒徑相近(圖2)。圖3 A、3 B和3 C分別顯示濃度為5×10-8、5×10-9和5×10-10M時大豆異黃酮-Lys-Lys-PD在水中形成高度為118 nm左右的納米粒, 且分散均勻。

圖2 大豆異黃酮-Lys-Lys-PD 水溶液(5×10-8 M)的透射電鏡形貌

圖3 大豆異黃酮-Lys-Lys-PD 水溶液的原子力顯微鏡形貌

3.2 討論

根據(jù)所得的血小板形貌圖可以看出圖1A為未活化的血小板，其形態(tài)基本保持在體內(nèi)循環(huán)血小板的形態(tài)，大多呈圓形狀態(tài)。圖1E為經(jīng)花生四烯酸活化的血小板，可見血小板有不同形狀偽足，且觀察到多個血小板呈現(xiàn)出明顯聚集形態(tài)。實驗觀察到的血小板整體形態(tài)與文獻[9]報道的電子顯微鏡下的形態(tài)基本一致，表明該實驗方法可行，可用于觀察血小板的形貌及相關實驗。通過考察大豆異黃酮-Lys-Lys-PD與未活化的血小板孵育，以及與經(jīng)花生四烯酸活化的血小板孵育，均發(fā)現(xiàn)在血小板表面存在納米顆粒，其大小與大豆異黃酮-Lys-Lys-PD在水溶液中形成的納米粒大小相近。圖1F、1G、1H可以觀察到雖然隨著大豆異黃酮-Lys-Lys-PD濃度降低發(fā)現(xiàn)個別血小板仍有偽足, 但未觀察到聚集現(xiàn)象。推斷大豆異黃酮-Lys-Lys-PD是以納米粒的形態(tài)粘附到了血小板表面，并與血小板表面的相關受體發(fā)生了相互作用，從而抑制了血小板活化。另外，由圖3也可以看出不同濃度的大豆異黃酮-Lys-Lys-PD在水溶液中的粒徑大小基本相同，推斷其在水溶液中形成的納米結(jié)構的大小不會隨濃度的改變而發(fā)生變化。

同時在實驗過程中發(fā)現(xiàn)制備血小板原子力顯微鏡樣品有以下幾點需要注意：(1)采血過程中所用的離心管、移液槍的槍頭和吸管必須硅烷化，目的是防止血細胞附著在管壁上面, 同時也預防血細胞碎裂發(fā)生溶血現(xiàn)象；(2)實驗過程中操作時動作要輕，以防對血小板產(chǎn)生過多刺激，使其活化；(3)溫箱孵育過程要控制溫度在 37℃，防止溫度過高會破壞血小板形貌；(4)樣品在經(jīng)3%戊二醛固定液固定后，進行超純水沖洗過程中，應選用濾紙從樣片碟側(cè)面吸走液體的方法，進行多次洗滌；(5)配制好的3%戊二醛固定液需存放在4℃低溫冰箱，因為長時間室溫儲存戊二醛分子之間易形成聚合體，影響對標本的固定；(6)原子力顯微鏡基底可以選用硅片或云母片。但是云母片在揭掉表層的過程中容易揭碎，需要反復多次操作以保證得到完整的云母表面，因此實驗中我們選用了硅片作為基底。

4 結(jié)語

原子力顯微鏡屬于力學顯微鏡，多用于材料及力學方面的測試，生物樣本的測試及相關研究少有文獻報道。原子力顯微鏡的生物樣品制備，雖然也需要固定和干燥，但是由于實驗是在大氣壓下進行，不需要真空狀態(tài)，所以在制樣的過程不需要將樣品完全脫水干燥，這樣就避免了樣品因干燥而變形的問題。另外原子力顯微鏡的成像是靠探針在樣品表面的掃描，圖像顯示的真實的樣品表面的形貌，并且能呈現(xiàn)出三維圖像。而且因為實驗設計考察納米結(jié)構小分子是否與血小板之間是否有相互作用，原子力顯微鏡掃描更能直觀的觀察到納米小分子與血小板的相互作用，可以根據(jù)血小板表面的突起的高低來測量納米小分子的大小，判斷其是否血小板有相互作用,這是其他類型顯微鏡無法滿足的。但是目前由于技術及儀器的局限性，該方法仍然需要在大氣環(huán)境下進行，液體環(huán)境下血小板活體成像還很難實現(xiàn)。相信隨著形態(tài)學研究科技的不斷發(fā)展，不遠的將來會有新的檢測技術能夠?qū)σ后w環(huán)境下血小板進行活體成像研究。