對西花薊馬高效金龜子綠僵菌菌株篩選及在花生田間的應用效果

裴松松，吳 軒，李瑞軍*，趙 丹，陸秀君，郭 巍

（1.河北農業(yè)大學植物保護學院，保定 071001；2.中國農業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

西花薊馬Frankliniella occidentalis隸屬纓翅目Thysanoptera薊馬科Thripidae花薊馬屬Frankliniella,是一種世界性的危險性害蟲，廣泛分布于全球69個國家及地區(qū)[1]，也是我國第一批重點防治的外來入侵物種[2]。西花薊馬在取食和產卵過程中，不僅直接為害寄主植物，還可以傳播病毒病[3]，如鳳仙壞死斑病毒（INSV）、番茄斑點病毒（TSWV）、番茄紅斑病毒（TCSV）[4]和花生環(huán)斑病毒（GRSV）[5]，嚴重影響作物的品質和產量。西花薊馬的防治方法主要是農業(yè)防治和化學防治，其中化學防治是防治西花薊馬的主要手段。由于西花薊馬世代短，繁殖力高和孤雌生殖，以及大量化學殺蟲劑的使用已導致西花薊馬對有機磷、有機氯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯和多殺菌素等多類殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性[6,7]。

金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae是一種寄主范圍廣泛，對人畜、作物、害蟲天敵及自然環(huán)境相對安全的蟲生真菌[8]，其通過寄主體壁進行主動入侵感染，侵染過程包括寄主識別、附著孢分化、穿透體壁、免疫拮抗及體內定殖等過程，由多因素作用導致寄主死亡，以達到防治害蟲的目的[9]。金龜子綠僵菌對西花薊馬的防治研究在國內外均有報道，Ansari等[10]研究發(fā)現(xiàn)，金龜子綠僵菌V275對西花薊馬的若蟲、蛹和成蟲均有較好的防治效果（致死率60%～90%），比化學農藥吡蟲啉或氟蟲腈單獨使用效果更好；Mburu[11]測定了18株蟲生真菌的分離物對西花薊馬若蟲的毒力，研究發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌分離物ICIPE69的LT50最短，且分離物中分生孢子的數(shù)量最高；Maniania等[12]在田間試驗中，比較了殺蟲劑樂果與金龜子綠僵菌對洋蔥上薊馬的防治效果，發(fā)現(xiàn)使用殺蟲劑和金龜子綠僵菌均降低了薊馬蟲口密度，每周使用金龜子綠僵菌最高產量為24000 kg/hm2，使用樂果產量最高為17000 kg/hm2。王興民等[13]測定了甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、多殺菌素、綠僵菌素（金龜子綠僵菌產生的一類環(huán)縮羧肽類毒素）對西花薊馬2齡若蟲的毒力，發(fā)現(xiàn)綠僵菌素對西花薊馬2齡若蟲的毒力最高。出于高效野生菌株的相繼分離和不同程度的田間防治效果，使人們對其寄予厚望。

我國是一個油料消費大國，也是油料進口大國。花生是我國主要的油料作物之一[14]。西花薊馬自2003年傳入我國，已逐步蔓延至北京、云南、浙江、山東等地，本文采用室內毒力測定和田間藥效試驗（試驗場地為河北農業(yè)大學農場試驗基地）的方法，研究金龜子綠僵菌對西花薊馬的防治效果，研究結果對西花薊馬的生物防治有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試蟲及菌株 供試西花薊馬為本實驗室連續(xù)飼養(yǎng)昆蟲，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對濕度（70±5）%，光周期16L:8D[16]，于20 cm×20 cm×20 cm養(yǎng)蟲盒飼養(yǎng)，以新鮮四季豆飼喂，取成蟲備用；供試黃粉蟲為本實驗室連續(xù)飼養(yǎng)昆蟲，飼養(yǎng)條件（25±3）℃，于61 cm×41 cm×18 cm白色塑料盆飼養(yǎng)，以麥麩、新鮮蔬菜葉飼喂；供試23株金龜子綠僵菌采自河北及北京地區(qū)土樣以土壤誘集法獲得（表1），菌株保存與活化采用PDA培養(yǎng)基。

表1 供試金龜子綠僵菌的編號及地理來源Table 1 The serial number and origin of M.anisopliae for bioassays

1.1.2 田間試驗藥劑 供試化學農藥見表2，優(yōu)良菌株為試驗中篩選得到的高毒力菌株F2-M18-8-4。

表2 試驗中所用藥劑Table 2 Pesticides used in the test

1.2 菌懸液制備

將菌株培養(yǎng)7 d后，用刮孢子器刮下所有孢子，加入0.05%吐溫-80，在研磨器充分研磨后，倒入燒杯在漩渦振蕩器上震蕩3 min，利用血球計數(shù)板計數(shù)，配制成1×108個孢子/mL的菌懸液備用。

1.3 金龜子綠僵菌的初篩

采用浸蟲法，用鑷子將黃粉蟲在菌懸液中浸沒3 s，放入墊有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，每個處理15頭試蟲，重復 3次；試蟲在人工氣候箱飼養(yǎng)，溫度（25±1）℃，相對濕度（70±5）%，光周期 16L:8D；連續(xù)10 d、每日記錄死蟲數(shù)，統(tǒng)計死亡率、毒力。

1.4 高毒力金龜子綠僵菌菌株誘變選育

以初篩獲得高毒力菌株為出發(fā)菌株，將出發(fā)菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d待其產孢，用0.05%吐溫-80配制成1×108個孢子/mL的孢子菌懸液，梯度稀釋至1×106個孢子/mL。在超凈工作臺中，用功率15W的紫外燈預熱30 min，取10 mL菌懸液加到直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿中置于磁力攪拌器上，距紫外線光源30 cm，照射5 min。取0.1 mL菌懸液到PDA培養(yǎng)基上均勻涂開，置于（25±1）℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7 d后，進行室內毒力測定，從最早發(fā)病死亡的僵蟲上分離、純化得到菌株作為F1代菌株，繼續(xù)按照上述方法，獲得F2代菌株。

1.5 金龜子綠僵菌室內毒力測定

參照濾紙藥膜法[17]，剪一片長方形無菌濾紙浸沒在菌懸液中，取出后自然風干放入長10 cm，直徑2 cm的塑料指形管中，將西花薊馬成蟲移至指形管中并放入適量新鮮四季豆，以1×108個孢子/mL為濃度，測定了金龜子綠僵菌M18-8-4及其2株誘變菌株對西花薊馬的毒力。以0.05%吐溫-80為對照，每個處理15頭試蟲，3個重復。每24 h觀察一次存活狀態(tài)，連續(xù)觀察10 d，以軟毛毛筆輕觸蟲體無反應判斷為死亡，記錄死蟲數(shù)，統(tǒng)計死亡數(shù)、毒力。試蟲飼養(yǎng)同1.3。

1.6 田間藥效試驗

種植花生品種為冀花-16，于4月中旬播種，穴間距為15 cm，行距為40 cm，花生生育期為苗期，試驗期間不施用任何其他化學藥劑。

將固液雙相發(fā)酵獲得的孢子粉，用含有0.05%吐溫-80的水制成菌懸液。金龜子綠僵菌以藥液用量30 L/667 m2噴霧，3種農藥按照表2的用量。

試驗前西花薊馬發(fā)生嚴重，每百穴（墩）花生西花薊馬蟲口量達1000頭左右。試驗設4種藥劑處理，以清水作為常規(guī)對照；每個處理設3個重復小區(qū)，共15個小區(qū)，小區(qū)隨機排列，每小區(qū)面積約30 m2。6月21日傍晚，以電動式噴霧器均勻噴霧。施藥前1 d及施藥后3 d、7 d、10 d、15 d，采用5點取樣法，每點調查5墩花生，記錄西花薊馬的蟲口量，同時調查花生新葉的受害程度。

花生葉片分級標準：0級，復葉葉片完好，無被害狀；1級，復葉葉片受害面積0＜x＜6%；3級，復葉葉片受害面積6%≤x＜26%；5級，復葉葉片受害面積26%≤x＜51%；7級，復葉葉片受害面積51%≤x＜76%；9級，復葉葉片受害面積x≥76%[18]。

測產試驗于花生收獲前1 d進行調查，采用5點取樣法，每點1 m2，稱量并記錄莢果重量[19]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與統(tǒng)計

使用SPSS 17.0軟件對室內毒力測定和田間藥效試驗進行數(shù)據(jù)分析[19-21]。

受害指數(shù)＝∑（各級受害葉數(shù)×相對級數(shù)值）/（調查總葉數(shù)×最高被害級）×100；保葉效果（%）＝（施藥前受害指數(shù)—施藥后受害指數(shù)）/施藥前受害指數(shù)×100；校正保葉效果（%）＝(施藥區(qū)保葉效果—清水對照區(qū)保葉效果)/（100—清水對照區(qū)保葉效果）×100；蟲口減退率（%）＝（施藥前蟲口數(shù)量—施藥后蟲口數(shù)量）/施藥前蟲口數(shù)量×100；校正蟲口減退率（%）＝（處理區(qū)蟲口減退率—對照區(qū)蟲口減退率）/（100—對照區(qū)蟲口減退率）×100；增產效果（%）＝（藥劑處理區(qū)產量—清水對照區(qū)產量）/清水對照區(qū)產量×100。

2 結果與分析

2.1 金龜子綠僵菌的初篩

空白對照的黃粉蟲在 10 d的平均自然死亡率為 0，菌株 M18-8-4、M18-8-6、M18-8-5、M18-8-19、M18-8-12、M18-8-7、M114造成黃粉蟲累計死亡率達到100%（圖1），顯著高于其他菌株對黃粉蟲的累計死亡率。生測中的蟲尸在保濕培養(yǎng)下，絕大部分蟲體在死亡2～3 d內長出白色菌絲，隨時間延長，蟲體逐漸布滿綠色孢子。

各菌株對黃粉蟲的致死中時 LT50在 3.68～19.36 d，不同菌株對黃粉蟲的毒力差異顯著，其中菌株M18-8-4的致死中時LT50最短，為3.68 d，雖然菌株M18-8-6、M18-8-5、M18-8-19、M18-8-12、M18-8-7、M114對黃粉蟲的累計死亡率也為100%，但致死中時LT50較長。其他菌株LT50顯著長于M18-8-4對黃粉蟲的LT50（圖1）。通過初篩，選擇致病力最高的菌株M18-8-4為優(yōu)良菌株進行下一步試驗。

圖1 23株金龜子綠僵菌對黃粉蟲10 d的累積死亡率和致死中時（平均值±SD）Fig.1 Cumulative mortalities and LT50 of 23 isolates against the T.molitor after 10 d treatment (Mean±SD)

2.2 金龜子綠僵菌對西花薊馬的毒力測定

金龜子綠僵菌M18-8-4及其紫外線誘變獲得的F1、F2代菌株對西花薊馬成蟲的毒力由高到低依次為菌株F2-M18-8-4、F1-M18-8-4、M18-8-4，致死中時分別為2.13 d、2.67 d、2.78 d（表3）。表明，誘變菌株F2-M18-8-4對西花薊馬成蟲毒力高于其他菌株對西花薊馬成蟲毒力。因此，選擇菌株F2-M18-8-4作為田間藥效試驗的高毒力菌株。

表3 出發(fā)菌株和誘變菌株對西花薊馬的毒力測定結果Table 3 Results of toxicity test of starting strain and mutant strain to F.occidentalis

2.3 對西花薊馬的田間防治效果

2.3.1 對西花薊馬的校正蟲口減退率 為驗證金龜子綠僵菌 F2-M18-8-4的防治效果，以田間防治西花薊馬常用3種化學農藥為參照，進行田間藥效對比試驗。4種處理對西花薊馬均有一定防治效果。施藥3 d后，金龜子綠僵菌F2-M18-8-4對西花薊馬的校正蟲口減退率顯著低于3種化學農藥，吡蟲啉、噻蟲嗪和乙基多殺菌素對西花薊馬的校正蟲口減退率分別達到66.48%、56.15%、62.47%；施藥7 d、10 d后，各處理對西花薊馬的校正蟲口減退率無差異，金龜子綠僵菌 F2-M18-8-4對西花薊馬的校正蟲口減退率分別為67.19%、68.73%；施藥15 d后，金龜子綠僵菌F2-M18-8-4對西花薊馬的校正蟲口減退率顯著高于3種化學農藥，為79.52%（表4）?？梢婋S著時間的延長，金龜子綠僵菌F2-M18-8-4對西花薊馬的校正蟲口減退率呈上升趨勢。

表4 各處理對西花薊馬施藥后不同天數(shù)的校正蟲口減退率Table 4 The corrected decrease rate of F.occidentalis on different days after different treatments application (%)

2.3.2 對花生的校正保葉效果 金龜子綠僵菌F2-M18-8-4和3種化學藥劑對花生校正保葉效果如表5所示。施藥3 d后，吡蟲啉和噻蟲嗪對花生的校正保葉效果最高，分別為48.18%、42.01%，與金龜子綠僵菌F2-M18-8-4校正保葉效果有顯著差異；施藥10 d后，吡蟲啉對花生的校正保葉效果最高，達61.76%，其次為金龜子綠僵菌F2-M18-8-4和噻蟲嗪，校正保葉效果分別為58.61%、56.02%；施藥15 d后，金龜子綠僵菌F2-M18-8-4的校正保葉效果最高，達63.58%，其次為乙基多殺菌素58.11%，吡蟲啉和噻蟲嗪校正保葉效果較差。

表5 各處理施藥后不同天數(shù)對花生的校正保葉效果Table 5 Corrective peanut leaf protection rate at different days after different treatments application

2.3.3 不同處理防治西花薊馬對花生增產效果 金龜子綠僵菌F2-M18-8-4防治西花薊馬花生的產量最高，為6034.20 kg/hm2，增產效果為9.09%；其次是乙基多殺菌素處理的產量為5940.90 kg/hm2，增產效果為7.40%，兩者間差異不顯著。吡蟲啉和噻蟲嗪處理增產效果較差，與金龜子綠僵菌處理間有顯著差異，與乙基多殺菌素處理間差異不顯著（表6）。

表6 不同處理防治西花薊馬后對花生的增產效果Table 6 Effect of different treatment on peanut production by controlling F.occidentalis

3 討論

利用黃粉蟲篩選蟲生真菌是一種經典的篩選方法，在初篩中毒力及死亡率均較高的M18-8-4、M18-8-6、M18-8-5、M18-8-19等菌株中，菌株M18-8-4對暗黑鰓金龜Holotrichia parallela、西花薊馬、棉鈴蟲Helicoverpa armigera、花生蚜Aphis medicaginis和甜菜夜蛾Spodoptera exigua等花生田主要害蟲均顯示較高毒力，本文主旨報道誘變菌株 F2-M18-8-4對西花薊馬的防治效果，其他試驗結果將另行報道。誘變后的真菌，其在人工培養(yǎng)基傳代后生物學性狀和殺蟲活性的穩(wěn)定性都是值得關注的問題，也是保證后續(xù)研究應用的前提，本試驗紫外線誘變后，選取生長性狀好的單菌落經培養(yǎng)后進行毒力測定，再從毒力高、僵蟲菌絲致密、分生孢子產量大的蟲體上分離、純化新菌株，以確保其毒力、抗紫外線能力及生長特性穩(wěn)定。

西花薊馬是典型的多食性害蟲，可為害包括豆科植物花生在內60多個科500多種植物[22]，對花生的產量造成嚴重影響[14]。田間害蟲調查中發(fā)現(xiàn)西花薊馬、花生蚜和甜菜夜蛾3類害蟲，其中以西花薊馬種類數(shù)量最多且危害嚴重，每百墩花生西花薊馬蟲口量達 1082頭，目前，西花薊馬已對多種化學農藥產生不同程度的抗性，萬巖然等[23]發(fā)現(xiàn)在北京地區(qū)與室內敏感品系相比，西花薊馬田間種群對多殺菌素的抗性倍數(shù)達到80～150倍；對乙基多殺菌素抗性倍數(shù)高達7730倍；對乙基多殺菌素的LC50值5年間最高增加了258倍；對甲維鹽和噻蟲嗪具有中等水平抗性；對阿維菌素和蟲螨腈處于敏感或低水平抗性。故此，田間害蟲發(fā)生時應優(yōu)選生物防治，如殺蟲真菌金龜子綠僵菌[10-13,24,25]、球孢白僵菌Beauveria bassiana[26,27]，捕食性天敵昆蟲巴氏新小綏螨Neoseiulus barkeri[28,29]、南方小花蝽Orius similis Zheng[30,31]等都應用于防治西花薊馬。金龜子綠僵菌對西花薊馬有較高毒力，Taro[25]發(fā)現(xiàn)在室內條件下，不同菌株引起的死亡率為 0～15.98%，表明篩選高毒力菌株是提高防治效果的主要途徑。本試驗通過生測和紫外誘變，選育得到對西花薊馬毒力較高的金龜子綠僵菌F2-M18-8-4。以3種化學農藥為對照，田間藥效試驗表明，施藥10 d后，金龜子綠僵菌F2-M18-8-4對西花薊馬的校正蟲口減退率達68.73%，與3種化學農藥相當，施藥15 d后，金龜子綠僵菌無論在對西花薊馬的校正蟲口減退率還是對花生的保葉效果上，均顯著高于3種化學農藥。試驗結果顯示，金龜子綠僵菌防治西花薊馬有較好的應用前景，生產上可與化學農藥交替、輪換使用，以減少化學農藥殘留并延緩害蟲抗藥性的發(fā)展。

在田間應用過程中，紫外線、溫度和濕度都會影響綠僵菌的防治效果，綠僵菌在較強紫外線的照射下會失去活力[32]。本試驗選擇在傍晚施菌，避開了較強的日光直射，為孢子萌發(fā)提供較適宜的環(huán)境條件。西花薊馬對于寄主植物的危害是多方面的,僅僅用蟲口數(shù)量不能充分反映其影響[33]；綠僵菌可以兼治寄主植物的多種害蟲[34]，如果每一種都調查蟲口減退情況，工作量將十分巨大；本試驗以保葉效果評價各處理的防治效果，不僅減少了田間工作量，還可以綜合評價各處理總的保護作物的效果。

在田間試驗中，基于金龜子綠僵菌侵染、發(fā)病過程，在施藥初期金龜子綠僵菌 F2-M18-8-4對西花薊馬的防治效果顯著低于化學農藥。有相關研究表明，綠僵菌與某些化學農藥聯(lián)合使用，可以提高防治效果[35]，我們將繼續(xù)研究金龜子綠僵菌 F2-M18-8-4與化學農藥協(xié)同使用的方式和效果，以期提高防治西花薊馬的效果。