牛筋草生防菌NJC-16的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

顧瓊楠，歐 翔，褚世海，黃啟超，陳安安，李儒海*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.中華人民共和國(guó)桂林海關(guān)，桂林 541004）

牛筋草Eleusine indica (L.) Gaertn.是農(nóng)田的一種惡性雜草，分布于中國(guó)南北各?。▍^(qū)）及全世界溫帶和熱帶地區(qū)，主要危害玉米、棉花、大豆等糧食作物，及蔬菜、果樹等經(jīng)濟(jì)作物[1]。使用化學(xué)除草劑是其主要的防除措施，然而隨著化學(xué)除草劑的大量使用，導(dǎo)致牛筋草抗藥性以及環(huán)境污染問(wèn)題日益加重，牛筋草的高效安全防除面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，因此開(kāi)發(fā)微生物除草劑或利用自然界生物中具有生物活性的代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)新的生物源除草劑成為高效防除牛筋草、進(jìn)而替代現(xiàn)有化學(xué)除草劑的有效途徑之一[2]。

自然界中植物致病微生物-真菌是開(kāi)發(fā)生物除草劑的重要來(lái)源[3]。目前，有超過(guò)40個(gè)屬的真菌已經(jīng)或正在被考慮開(kāi)發(fā)成生物除草劑，其中包括刺盤孢菌屬 Colletotrichum、疫霉屬 Phytophthora、鐮刀菌屬Fusarium、交鏈孢菌屬Alternaria等[4]。其中，炭疽菌已應(yīng)用于防除多種雜草[5]，如膠孢炭疽菌菟絲子專化型Colletotrichum gloeosporiodes (Penz.) Sacc.f.sp.cuseutae的商品化除草劑“魯保一號(hào)”對(duì)大豆田菟絲子有明顯的防除效果[6]。盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢合萌?；虲.gloeosporioides f.sp.aeschynomene的商品化除草劑“Collego”能夠用來(lái)防除水稻及大豆田間生長(zhǎng)的豆科雜草，如弗吉尼亞合萌等[7]。瓜類炭疽菌C.orbiculare可以用來(lái)防治澳大利亞牧羊區(qū)和灌溉作物中的雜草刺蒼耳[8]。禾谷炭疽菌C.graminicola菌株KA001可用來(lái)防除水稻田里的稗屬雜草[9]。盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢錦葵專化型C.gloeosporioides f.sp.malvae的商品除草劑“Bio Mal”主要用于防治圓葉錦葵[10]。豬毛菜炭疽菌C.gloeosporioides f.sp.salsolae可以用來(lái)防除北美地區(qū)農(nóng)田中的入侵性雜草豬毛菜或風(fēng)滾草[11]。此外，平頭炭疽菌C.truncatum可以用來(lái)防治大果田菁[12]及巴西農(nóng)田雜草狼把草[13]。膠孢炭疽菌C.gloeosporioides可以防除夏威夷森林中的惡性雜草毛野牡丹藤[14]。蒲黃炭疽菌C.typhae有防治水生雜草香蒲的潛力[15]。雖然已有許多炭疽菌在雜草防除上的報(bào)道，但是利用炭疽菌防治牛筋草的報(bào)道較少。

為了進(jìn)一步挖掘適合于湖北省牛筋草的生防菌資源，本研究前期從牛筋草植株上分離出一株強(qiáng)致病力炭疽菌菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)對(duì)該病原菌進(jìn)行分類鑒定，并通過(guò)對(duì)病原菌的生物學(xué)特性、生防效果和作物安全性的評(píng)估，明確該菌的生物學(xué)特性，以期為研究牛筋草生物除草劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株：牛筋草、稗、馬唐、大巢菜等雜草種子均為本實(shí)驗(yàn)室采集并保存，反枝莧種子由南寧海關(guān)技術(shù)中心桂林分中心實(shí)驗(yàn)室提供。玉米、小麥、水稻品種分別為鄂玉24、鄭麥9023及晚秈98。菌株NJC-16分離于湖北省武漢市江夏區(qū)金水農(nóng)場(chǎng)玉米田自然發(fā)病的牛筋草植株。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂（Potato sucrose agar，PSA）培養(yǎng)基、燕麥瓊脂（Oatmeal agar medium，OA）培養(yǎng)基、燕麥番茄瓊脂（Oatmeal tomato agar medium，OTA）培養(yǎng)基、胡蘿卜瓊脂（Carrot agar medium，CA）培養(yǎng)基、綠豆汁（Mung bean agar medium，MBA）培養(yǎng)基、查氏（Czapek）培養(yǎng)基等基本配方參考方中達(dá)[16]的方法。

試劑及儀器：Green Taq Mix，南京諾唯贊生物科技公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Eppendorf Centrifuge 5810R,德國(guó)Eppendorf公司；Olympus IX81顯微鏡，日本Olympus公司；東勝ETC811 PCR擴(kuò)增儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離及致病性測(cè)定 采用常規(guī)組織分離法分離病原菌，用清水洗凈病葉并剪取4 mm×4 mm的病健交界處組織，用75%乙醇處理30 s，0.1%升汞消毒1～2 min，無(wú)菌水沖洗3遍，接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)5 d，將獲得的菌株通過(guò)單孢純化后保存在PDA斜面及濾紙片上，分別置于4 ℃及-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

致病性測(cè)定采用菌絲塊離體接種及分生孢子液活體接種進(jìn)行。菌絲塊接種：從三葉期健康牛筋草植株上選取大小一致的無(wú)病害葉片20片，70%酒精1 min進(jìn)行表面消毒，打取直徑為5 mm的菌絲塊，接種至牛筋草健康葉片上；以接種PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，置于30 cm×50 cm的瓷盤內(nèi)25 ℃保濕培養(yǎng)，接種2 d后移去菌絲塊，觀察發(fā)病情況。

分生孢子懸浮液活體接種：收集牛筋草炭疽菌的分生孢子，將分生孢子配成濃度為1×106孢子/mL的分生孢子懸浮液。牛筋草植株種于10 cm的花盆中，每盆10～15株，將配制好的分生孢子懸浮液以10 mL/盆的接種量（含0.05%的吐溫80）均勻噴灑到3葉期的健康牛筋草植株上，以含0.05%的吐溫80的無(wú)菌水作對(duì)照，25 ℃、黑暗保濕培養(yǎng)2 d后，16 h/8 h光/暗培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行再分離、培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察分離得到的菌株是否為原接種菌株。

1.2.2 病原菌鑒定 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定：將病原菌接種到 PDA、PSA平板上，25 ℃光照培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)、顏色、分生孢子及附著胞的特征等，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[17]及Crouch等[18]的方法，對(duì)病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定。

病原菌的分子鑒定：采用CTAB法提取病原菌株的基因組DNA。采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴(kuò)增該病原菌的目的基因序列，引物均由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，反應(yīng)液組分為：Green Taq Mix 12.5 μL（諾唯贊生物科技公司，南京），模板DNA 1 μL，引物ITS1和ITS4（25 μmol/L）各1 μL，加ddH2O使總體積達(dá)到25 μL，在東勝ETC811 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序委托武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行，所得到的核苷酸序列與 GenBank（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，使用MEGA 7.0軟件將供試菌株的ITS序列與BLAST上同源性高的菌株序列進(jìn)行比對(duì)，采用鄰近法（neighbor-joining，NJ）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株NJC-16的生物學(xué)特性測(cè)定 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響：將直徑為6 mm的菌絲塊，分別接至PDA、PSA、OTA、OMA、CA、MBA平板的中央，在25 ℃條件下培養(yǎng)，7 d后觀察菌絲生長(zhǎng)情況，并采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并用5 mL的ddH2O洗平板，四層擦鏡紙過(guò)濾，對(duì)分生孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響：將直徑為6 mm的菌絲塊，接至PDA平板中央，分別在5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每處理5次重復(fù)。

光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響：將直徑為6 mm的病原菌菌絲塊接至PDA平板中央，將平板分別置于連續(xù)光照、12 h光暗交替、連續(xù)黑暗的人工氣候培養(yǎng)箱，25 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每處理5個(gè)重復(fù)。

pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響：打取直徑為6 mm的菌絲塊，接至PDA平板中央， pH分別設(shè)為4、5、6、7、8、9和10，25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每處理5個(gè)重復(fù)。

碳、氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響：以查氏（Czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用等質(zhì)量碳元素的葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇、半乳糖、山梨醇、麥芽糖、檸檬酸鈉、果糖、乳糖替代蔗糖，以不加碳源的查氏培養(yǎng)液作為對(duì)照；用等質(zhì)量氮元素的酵母浸粉、蛋白胨、甘氨酸、硝酸銨、氯化銨、硝酸鈉代替 KNO3，以不加氮源的查氏培養(yǎng)液作為對(duì)照。打取直徑為6 mm的菌絲塊接至含不同碳（氮）源的PDA平板上，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每處理5個(gè)重復(fù)。

病原菌菌絲致死溫度的測(cè)定：將直徑為6 mm的病原菌菌絲塊接至無(wú)菌試管中，加入2 mL滅菌水，置于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的水浴中加熱10 min，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，然后接種于PDA平板中央，25 ℃光照培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，10 d后觀察菌落最終生長(zhǎng)情況。

1.2.4 菌株NJC-16對(duì)不同雜草的防效 將菌株NJC-16接種于PSB培養(yǎng)基，25 ℃、220 r/min培養(yǎng)7 d，收集分生孢子并配制成濃度為1×106孢子/mL的分生孢子懸浮液（含0.05%的吐溫80）。每盆噴施10 mL分生孢子懸浮液于3葉期稗草、馬唐和反枝莧等雜草植株上，25 ℃、黑暗保濕培養(yǎng)2 d后，16 h/8 h光/暗培養(yǎng)。以噴施0.05%的吐溫80的植株為對(duì)照，21 d后觀察植株的發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、致死率，并收集雜草地上部分，統(tǒng)計(jì)鮮重抑制率。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 作物安全性測(cè)定 將濃度為1×106孢子/mL的分生孢子懸浮液（含0.05%的吐溫80）噴施2～3葉期玉米、小麥和水稻植株，接種量及培養(yǎng)方法同1.2.4。接種7 d后，觀察供試玉米、小麥和水稻的發(fā)病情況。21 d后收集作物地上部分，統(tǒng)計(jì)鮮重抑制率，鮮重抑制率（%）＝（對(duì)照平均鮮重－處理平均鮮重）/對(duì)照平均鮮重×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 15.10軟件和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用最小顯著差數(shù)（LSD）法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛筋草病原菌的分離及致病性

采用常規(guī)組織分離法對(duì)采集的病葉進(jìn)行病原菌的分離。從分離的不同真菌中選擇代表性菌株進(jìn)行致病性測(cè)定結(jié)果表明，只有接種代表菌株NJC-16時(shí)，牛筋草的葉片產(chǎn)生黑褐色輪紋狀病斑。

離體接種牛筋草葉片在25 ℃下保濕培養(yǎng)24 h后，葉片病斑初為水漬狀，隨發(fā)病時(shí)間延長(zhǎng)逐漸擴(kuò)展為黑褐色輪紋狀。活體接種分生孢子懸浮液的牛筋草植株在噴霧接種3 d后產(chǎn)生水漬狀病斑，后逐漸擴(kuò)大并形成黑褐色輪紋狀病斑。2種接種方法產(chǎn)生的癥狀均與田間自然發(fā)病癥狀一致，從發(fā)病葉片上重新分離到的病原菌與原接種菌株培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征一致，進(jìn)一步確認(rèn)菌株NJC-16為牛筋草的致病菌。

圖1 牛筋草炭疽菌田間發(fā)病癥狀及室內(nèi)接種癥狀Fig.1 Symptoms of anthracnose disease of goosegrass

2.2 菌株NJC-16的鑒定

對(duì)牛筋草病原菌菌株NJC-16進(jìn)行了形態(tài)學(xué)上的鑒定，菌株NJC-16在PDA培養(yǎng)基上菌落呈圓形，邊緣規(guī)則，絨狀，25 ℃培養(yǎng)條件下7 d菌落直徑為5.9 cm，菌落初期白色，后期為黑色（圖2A）；在PSA培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣規(guī)則，呈絨狀，25 ℃培養(yǎng)條件下7 d菌落直徑為6.1 cm，菌落初期白色，后期為黑色，氣生菌絲較多（圖2B），菌絲有隔，透明，0.6～5.0 μm，有脂滴。

分生孢子無(wú)色，單孢，長(zhǎng)橢圓狀或鐮刀狀，大小為（2.8～4.6）μm×（7.3～11.8）μm，分生孢子內(nèi)含脂滴（圖 2C）。附著胞圓形或長(zhǎng)圓形，卵球形或倒卵球形或棒狀，邊緣光滑，少有葉瓣?duì)罡街?，大小為?.3～6.0）μm×（6.7～11.6） μm（圖2D），初步通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定菌株NJC-16為子囊菌亞門腔孢綱黑盤孢目禾生炭疽菌復(fù)合種C.graminicola complex下的牛筋草炭疽菌C.eleusines。

圖2 生防菌NJC-16的形態(tài)特征Fig.2 Symptoms of NJC-16

分子鑒定采用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到554 bp大小的片段，將此片段在GenBank中進(jìn)行 BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株與牛筋草炭疽菌（MAFF 511155）的同源性最高，為99.62%。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，菌株NJC-16序列與牛筋草炭疽菌遺傳距離最近，聚在一起（圖 3），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定結(jié)果，將菌株NJC-16鑒定為牛筋草炭疽菌。

圖3 基于ITS序列采用NJ法構(gòu)建菌株NJC-16及其相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain NJC-16 and related strains based on ITS sequences by the NJ method

2.3 菌株NJC-16的生物學(xué)特性

2.3.1 菌株NJC-16在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng) 將菌株NJC-16分別在PDA、PSA、OTA、OMA、CA及MBA培養(yǎng)基上25 ℃黑暗培養(yǎng)，在OMA、PSA、PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最好，生長(zhǎng)速度較快，培養(yǎng)7 d后菌落直徑分別為6.2、6.1和5.9 cm；但在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)孢有明顯差別，在OTA、MBA、PSA上產(chǎn)孢情況較好，產(chǎn)孢量分別為75×105、43×105和33×105孢子/皿，在CA、PDA、OMA固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較差（表1）。

表1 菌株NJC-16在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量Table 1 The growth rate and the sporulation of strain NJC-16 on different culture media

2.3.2 溫度、光照及pH對(duì)菌株NJC-16的生長(zhǎng)影響 不同溫度對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響差異顯著。菌株NJC-16在20 ℃～30 ℃生長(zhǎng)較好，其中25 ℃最適合菌絲生長(zhǎng)，生長(zhǎng)5 d后的菌落直徑達(dá)到45.0 mm；在5 ℃以下及35 ℃以上時(shí)，菌株NJC-16菌絲不生長(zhǎng)（圖4）。

圖4 不同溫度對(duì)牛筋草炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of temperature on mycelial growth of the pathogen C.eleusines

不同光照條件對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)影響不顯著。在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)5 d，菌落平均直徑分別為55.3、54.6、54.6 mm（圖5），無(wú)明顯差異。

圖5 不同光照條件對(duì)牛筋草炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of illumination on mycelial growth of the pathogen C.eleusines B

不同pH對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響差異顯著。菌株NJC-16在pH為4～10的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，菌落直徑表現(xiàn)為先增加后減少，在pH為6～9時(shí)生長(zhǎng)最好，當(dāng)pH＜5和pH＞10時(shí)生長(zhǎng)速率開(kāi)始受到抑制（圖6）。

圖6 不同pH對(duì)牛筋草炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of pH on mycelial growth of the pathogen C.eleusines C

2.3.3 碳源和氮源對(duì)菌株NJC-16生長(zhǎng)的影響 菌株NJC-16在10種不同碳源和7種不同氮源的培養(yǎng)基質(zhì)條件下都能夠生長(zhǎng)，但對(duì)不同碳、氮源的利用程度不同。在不同碳源中，菌株 NJC-16對(duì)淀粉的利用效率最高，培養(yǎng)5 d后菌落直徑為8.35 cm，其次是葡萄糖和麥芽糖，而對(duì)檸檬酸鈉利用效果最差。在不同氮源中，菌株 NJC-16對(duì)酵母浸提液的利用效率最高，培養(yǎng)5 d后的菌落直徑為8.50 cm，其次為甘氨酸和蛋白胨，對(duì)氯化銨利用效果最差，生長(zhǎng)緩慢（表2）。

2.3.4 病原菌的致死溫度 用不同溫度的水浴處理供試菌株的菌絲塊結(jié)果表明，菌絲塊在35 ℃～60 ℃水浴處理10 min后，置于PDA平板上培養(yǎng)，5 d后均可長(zhǎng)出菌絲，而經(jīng)65 ℃、70 ℃處理下，培養(yǎng)10 d后仍未觀察到菌絲生長(zhǎng)，由此初步判斷病原菌菌絲的致死溫度為65 ℃、10 min。

2.4 菌株NJC-16對(duì)不同雜草防效分析

將菌株NJC-16的分生孢子液分別接種于三葉期的牛筋草、稗草、馬唐、千金子、大巢菜、反枝莧等雜草植株。室內(nèi)生防試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株NJC-16分生孢子懸浮液對(duì)牛筋草生防效果最佳，接菌21 d后牛筋草發(fā)病率為83.2%，致死率達(dá)89.7%，鮮重抑制率達(dá)73.2%；對(duì)馬唐、千金子和反枝莧的生防效果較差，鮮重抑制率僅為5.8%、5.2%、9.4%；稗草雖然發(fā)病，但是卻不致死；接種大巢菜21 d后在大巢菜葉片上可見(jiàn)菌落，但致死率以及鮮重抑制率均不高（表3）。

2.5 作物安全性分析

將菌株NJC-16分生孢子液分別接種3葉期的玉米、小麥及水稻植株，室內(nèi)作物安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，在噴霧菌株NJC-16分生孢子液7 d后，玉米（鄂玉24）、小麥（鄭麥9023）和水稻（晚秈98）葉片均沒(méi)有明顯病斑；21 d后，玉米、小麥和水稻等作物鮮重沒(méi)有明顯的抑制，表現(xiàn)為安全（表4）。

表4 菌株NJC-16孢子液對(duì)不同作物的安全性比較Table 4 Comparison of the effect of NJC-16 strain spores on the safety of different crops

3 討論

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)以極高的規(guī)模為人類提供高質(zhì)量的農(nóng)產(chǎn)品，這在一定程度上是通過(guò)合理使用農(nóng)藥來(lái)實(shí)現(xiàn)的，農(nóng)藥保護(hù)作物不受病蟲害的侵害、減少雜草的競(jìng)爭(zhēng)，從而有助于保持作物的高產(chǎn)。然而，近年來(lái)因長(zhǎng)期大量使用化學(xué)除草劑造成的環(huán)境污染和雜草抗藥性問(wèn)題日益嚴(yán)峻，急需開(kāi)發(fā)新的雜草管理方法[19]。隨著人們對(duì)植物病原菌研究的不斷深入，微生物除草劑的開(kāi)發(fā)研究獲得了良好進(jìn)展。從自然發(fā)病的雜草病株中篩選出來(lái)的植物病原菌具有較強(qiáng)的除草活性，因此有開(kāi)發(fā)成為微生物除草劑的潛力。微生物除草劑具有對(duì)目標(biāo)雜草選擇性高、環(huán)境負(fù)效應(yīng)小、對(duì)作物安全性高等優(yōu)點(diǎn)，亦可以滿足全球?qū)τ袡C(jī)農(nóng)產(chǎn)品長(zhǎng)期增長(zhǎng)的需求[20]。

評(píng)價(jià)生物防治的潛力指標(biāo)涉及菌株生物學(xué)特性、毒力水平等方面[21]。據(jù)報(bào)道，牛筋草炭疽菌在 PDA培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢均較好，在多種真菌培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，表明該菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求比較低[22]。在本研究中，牛筋草炭疽菌菌株NJC-16在PDA、PSA、OTA、MB等培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，在PSA上生長(zhǎng)產(chǎn)孢較好，在以淀粉和酵母浸提液為碳、氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，這為低成本大規(guī)模人工培養(yǎng)提供了依據(jù)。另外，牛筋草炭疽菌對(duì)溫度適應(yīng)性較廣，溫度對(duì)炭疽菌產(chǎn)孢、孢子的萌發(fā)及后續(xù)的侵染起著重要的作用。在不同的炭疽菌中，不同孢子的生長(zhǎng)最適溫度也不近相同[23]，香蕉炭疽病菌C.musae生長(zhǎng)最適溫度為27 ℃～30 ℃[24]，馬鈴薯炭疽病C.coccodes 生長(zhǎng)最適溫度在20 ℃～30 ℃[25]。在本研究中，菌株NJC-16最適生長(zhǎng)溫度和最適產(chǎn)孢溫度均為25 ℃～30 ℃，該菌的生長(zhǎng)適合湖北省牛筋草生長(zhǎng)期高溫、高濕的氣候。并且該菌對(duì)pH和光照條件均不敏感，在不同的pH及光照條件下產(chǎn)孢無(wú)明顯差異。綜上，在生物學(xué)特性上該菌株非常利于其在生物防治上的應(yīng)用，是一種很有應(yīng)用前景的植物病原真菌。

此外，獲得的牛筋草炭疽菌菌株 NJC-16能引起牛筋草發(fā)病，對(duì)牛筋草具有良好的防效。前人研究報(bào)道，在牛筋草上分離出幾種病原真菌，主要有牛筋草平臍蠕孢、狗尾草平臍蠕孢、香茅彎孢、長(zhǎng)喙凸臍胞、灰梨孢等[26]。這些分離出的病原真菌不僅對(duì)牛筋草有致病性，對(duì)其他禾本科的雜草也有相應(yīng)的致病性。對(duì)菌株NJC-16初步的寄主范圍測(cè)定表明對(duì)其他雜草如稗草、馬唐、反枝莧、大巢菜等雜草的防效一般，說(shuō)明菌株 NJC-16對(duì)牛筋草有較好的寄主專一性。初步的生物安全試驗(yàn)表明，該菌株不侵染玉米、小麥和水稻等大田作物，接種后不產(chǎn)生典型的水漬狀病斑，對(duì)以上作物的生物安全性較高。菌株NJC-16對(duì)牛筋草具有良好防效，同時(shí)對(duì)其他常見(jiàn)作物安全，因此有開(kāi)發(fā)為牛筋草生防菌的潛力。

獲得一個(gè)有潛力開(kāi)發(fā)為生物除草劑的生防菌株是開(kāi)發(fā)生物除草劑的前提和基礎(chǔ)，但離成功開(kāi)發(fā)一個(gè)商用的生物除草劑仍有許多工作要做。如牛筋草炭疽菌菌株NJC-16，需要進(jìn)一步擴(kuò)大寄主測(cè)定范圍，尤其對(duì)其在田間的使用進(jìn)行安全評(píng)估。在后續(xù)工作中，還可以對(duì)該菌株進(jìn)行基因改良，提高其產(chǎn)孢量及致病性。同時(shí)可對(duì)其發(fā)酵液中的活性物質(zhì)進(jìn)行提取及鑒定，從該菌株中的天然產(chǎn)物入手，通過(guò)生物信息學(xué)等方法，有針對(duì)性地發(fā)現(xiàn)除草活性物質(zhì)，鑒定其結(jié)構(gòu)，以開(kāi)發(fā)新的生物農(nóng)藥。