樊小群, 李 歡, 朱華雄, 黃健平, 何呂芬
(海南省三亞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科, 三亞 572000)
結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤。在全球范圍內(nèi)已90%以上的結(jié)腸癌患者死亡[1],盡管改良的篩查技術(shù)和先進(jìn)的治療方法有助于提高患者的生存率,但是仍沒有一種完善方案的治療結(jié)腸癌[2]。因此亟需探索新型控制結(jié)腸癌的治療策略。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn),抑制腫瘤的代謝途徑可有效抑制腫瘤發(fā)生,而6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)是糖代謝過程重要的酶之一,在腫瘤的生存中發(fā)揮重要作用[3]。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類小的非編碼RNA,通過靶向mRNA降解或翻譯抑制來控制基因表達(dá)[4],mir-335-5p作為結(jié)腸癌抑制因子的作用已被證實(shí)[5]。然而,mir-335-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞中抑制生長(zhǎng)增殖、凋亡的機(jī)制是否與G6PD相關(guān)尚未清楚。本研究通過體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480,探究mir-335-5p過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡的影響并初步探討其機(jī)制。
人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和結(jié)腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells,IEC)均購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),miR-335-5p mimic質(zhì)粒、miR-335-5p NC質(zhì)粒購(gòu)自于上海吉?jiǎng)P基因有限公司設(shè)計(jì)并合成購(gòu)自于上海吉?jiǎng)P基因(miR-335-5p模擬物序列為5'-UACAGUACUGUGAUAACUG AA-3',模擬陰性對(duì)照(NC)序列為5 '-GTTCTCCGAAAACGTGTCACGT-3'),Lipofectamine 3000(貨號(hào)L3000001)、PCR試劑盒(貨號(hào) 14966005)均購(gòu)自于美國(guó)ThermoFisher公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)K1622)購(gòu)自于美國(guó)Fermentas公司,Trizol(貨號(hào)46301)購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司,熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)E2920)購(gòu)自于美國(guó)promega公司,熒光素酶報(bào)告載體由上漢恒生物公司提供,抗體G6PD(貨號(hào)ab993)、抗體Bcl-2(貨號(hào)ab185002)、抗體Bax(貨號(hào)ab32503)均購(gòu)自于美國(guó)abcom公司,MTT試劑盒(貨號(hào)M1025 )購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。
酶標(biāo)儀(型號(hào)TECAN spark)購(gòu)自于帝肯(上海)貿(mào)易有限公司,電泳儀(型號(hào)1658001)購(gòu)自于美國(guó)Bio-Rad公司。熒光定量PCR儀(型號(hào)ABI9700 )購(gòu)自于美國(guó)ABI公司
人源性結(jié)腸癌細(xì)胞SW480與正常結(jié)腸細(xì)胞IEC分別接種于含1%雙抗(青霉素和鏈霉素),10%FBS 1640培養(yǎng)基中,放置于37℃,5% CO2孵育箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合至80%~90%時(shí),用0.25%的胰蛋白酶常規(guī)消化,1 500 r/min離心5 min,棄去上清,制備細(xì)胞懸液,接種于無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。
設(shè)置正常結(jié)腸癌細(xì)胞組、空白對(duì)照組、NC組、miRNA-335-5p mimic組;取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞SW480,消化,離心后細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/ml,每孔1 ml鋪于6孔板,將空白對(duì)照組、NC組、miRNA-335-5p mimic組按照Lipofectamine 3000說明書分別用不含血清的培養(yǎng)基稀釋pcDNA3.1-NC質(zhì)粒和pcDNA3.1-miR-335-5p mimic質(zhì)粒(125 μl)與Lipofectamine 3000混合均勻,對(duì)NC組、miRNA-335-5p mimic組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,空白對(duì)照組每孔250 μl加無血清的培養(yǎng)基。37℃靜置20 min,分別加入6孔板,繼續(xù)培養(yǎng)6 h,以每孔2 ml更換新鮮完全養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每組分別設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。
取培養(yǎng)48 h正常結(jié)腸細(xì)胞及空白對(duì)照組、NC組、miR-335-5p mimic組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,分別用TrIzol從中提取總RNA,根據(jù)引物合成軟件Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物序列如(表1)所示,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA合成cDNA,并擴(kuò)增,按照定量PCR試劑盒說明書配20μl反應(yīng)體系,反應(yīng)條件95℃預(yù)變性15 min、95℃變性10 s、56℃退火20 s、72℃延伸50 s,40個(gè)循環(huán),分別以U6、GAPDH為對(duì)照,分析miR-335-5p、G6PD mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2-△△Ct表示。
Tab. 1 Primer sequences of qRT-PCR
分別構(gòu)建含有野生型G6PD 3′-UTR和突變型G6PD 3′-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(Wt-G6PD 3′-UTR:5'-GGAATTCACCATGGCAGAGCAGGTGGCCCT-3'和Mut-G6PD 3′-UTR:5'-GTGGTTTGTCCAAACTCATC-3')。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)腸癌細(xì)胞SW480,用含10%FBS和1%雙抗的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×105cells/well,接種于24孔板中,將335-5p mimic或NC分別與Wt-G6PD 3′-UTR質(zhì)粒和Mut-G6PD 3′-UTR質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至共轉(zhuǎn)染至腸癌細(xì)胞SW480,每組6個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒操作說明對(duì)熒光素酶活性測(cè)定。
1.4中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,在避光條件下每孔分別加入20 μl MTT溶液(濃度5 mg/ml),放入孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出,棄去培養(yǎng)基,每孔加入150 μl DMSO放于搖床震蕩10 min,待結(jié)晶完全溶解后在酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處各孔的OD值。按照相同的方法測(cè)定轉(zhuǎn)染后48 h、72 h處各孔的OD值,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析各組細(xì)胞的生長(zhǎng)活性情況。細(xì)胞生長(zhǎng)活性=轉(zhuǎn)染組OD值/對(duì)照組OD值×100%。
1.4中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞,按照Annex-in V-FITC凋亡試劑盒方法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。右上象限C2為晚期凋亡細(xì)胞,右下象限C4為早期凋亡細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率即為(C2+C4)%。
1.4中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h,每組細(xì)胞PBS清洗,加入含PMSF的RIPA裂解液,提取蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,按照4∶1在蛋白中加5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,沸水浴加熱3~5 min,放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備12%分離膠和5%濃縮膠,上樣量30 μg,上樣后進(jìn)行蛋白凝膠電泳,根據(jù)蛋白marker切膠,轉(zhuǎn)膜,加入抗體G6PD,Bax,Bcl-2(均1∶500稀釋)孵育,放置4℃過夜,TBST清洗,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育1 h,TBST清洗后,參考ECL發(fā)光液說明書對(duì)條帶孵育、曝光、顯影。Image J對(duì)條帶灰度值分析。
與正常結(jié)腸細(xì)胞相比,空白對(duì)照組、NC組結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞中miR-335-5p相對(duì)表達(dá)水平降低,G6PD mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對(duì)照組、NC組相比,miR-335-5p mimic組細(xì)胞中miR-335-5p相對(duì)表達(dá)水平顯著升高,G6PD mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。
Tab. 2 Relative expression levels of mir-335-5p and G6PD mRNA in cells of each n=6)
與空白對(duì)照、NC組相比,同一時(shí)間miR-335-5p mimic組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長(zhǎng)活性顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 表3)。
Tab. 3 Effects of over expression of mir-335-5p on proliferative activity of SW480 cells(%, n=6)
與空白對(duì)照(9.21±3.26)%、NC組(10.76± 4.29)%相比,轉(zhuǎn)染48 h后miR-335-5p mimic組 (51.10±6.34)%結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05,圖1)。
Fig. 1 Flow cytometry results of SW480 cell apoptosis in each group
miR-335-5p mimic+WT-G6PD 3′-UTR組(1.69±0.13)%熒光素酶相對(duì)活性低于miR-335-5p NC+WT-G6PD 3′-UTR組(2.47±0.22)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),miR-335-5p mimic+MUT-G6PD 3′-UTR組(2.40±0.29)%與miR-335-5p NC+MUT-G6PD 3′-UTR組(2.44±0.33)%比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
與空白對(duì)照組、NC組相比,miR-335-5p mimic組G6PD、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bax、caspase3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,圖2,表4)。
Fig. 2 Expressions of G6PD and apoptosis related proteins in SW480 cells by over expression of mir-335-5p
結(jié)腸癌是一類發(fā)病率和致死率較高的惡性腫瘤,臨床上主要是通過手術(shù)治療、放療和化療相結(jié)合的方法治療結(jié)腸癌[6、7],但是仍達(dá)不到預(yù)期的效果,因此研究治療結(jié)腸癌新的靶點(diǎn)成為目前研究熱點(diǎn)。研究證實(shí)miRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。miRNAs是非編碼RNA,可與多靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合不完全,增強(qiáng)其降解和抑制其翻譯功能[8-10]。mir-335-5p是與癌癥相關(guān)的miRNAs之一,研究發(fā)現(xiàn)mir-335-5p由基因組區(qū)域染色體7q32.2轉(zhuǎn)錄而來,受DNA甲基化的調(diào)節(jié),參與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡的調(diào)控表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),與正常結(jié)腸細(xì)胞相比,mir-335-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中表達(dá)顯著降低,提示mir-335-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中低表達(dá)。為進(jìn)一步研究mir-335-5p在結(jié)腸癌中的作用,本實(shí)驗(yàn)通過Lipofectamine 3000向結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中轉(zhuǎn)染miR-335-5p mimic,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組、NC組相比,miR-335-5p mimic組細(xì)胞中miR-335-5p mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高,提示在成功建立miR-335-5p過表達(dá)模型,可用于下一步實(shí)驗(yàn)。
結(jié)腸癌細(xì)胞SW480具有無限增殖能力,研究發(fā)現(xiàn)mir-335-5p表達(dá)缺失可導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生,推測(cè)mir-335-5p可調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞增殖活性[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照、NC組相比,同一時(shí)間miR-335-5p mimic組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長(zhǎng)活性顯著降低,提示miR-335-5p過表達(dá)可降低結(jié)腸癌細(xì)胞SW480生長(zhǎng)活性。研究表明mir-335-5p可誘導(dǎo)乳腺癌,胃癌等癌細(xì)胞凋亡[13]。Bcl-2是一種抑制細(xì)胞凋亡基因,和細(xì)胞中促凋亡基因Bax處于一定平衡狀態(tài),結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡,延長(zhǎng)細(xì)胞生存時(shí)間。Caspase-3是線粒體細(xì)胞凋亡過程中的一種重要酶,是細(xì)胞凋亡過程的重要執(zhí)行者,其過表達(dá)可加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照、NC組相比,轉(zhuǎn)染48 h后miR-335-5p mimic組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡率顯著升高,Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低,Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高,提示miR-335-5p過表達(dá)能提高結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率,促使Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,Bax蛋白表達(dá)水平升高,促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡。
研究發(fā)現(xiàn)miR-335-5p在骨肉瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用截然相反[16],推測(cè)不同腫瘤中miR-335-5p調(diào)控的靶基因不同,從而激活相應(yīng)的信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不同作用。已知G6PD是戊糖磷酸途徑中限速酶,為細(xì)胞生長(zhǎng)增殖提供核糖和NADPH,是維持細(xì)胞分裂增殖的重要物質(zhì)[17]。研究發(fā)現(xiàn)G6PD水平在黑色素瘤、白血病和乳腺癌等多種腫瘤中較高[18-20],許多數(shù)據(jù)表明G6PD水平升高與結(jié)腸癌發(fā)生呈正相關(guān)。另有研究證實(shí)G6PD在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量高于正常細(xì)胞,可為腫瘤細(xì)胞提供能量[21]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常結(jié)腸細(xì)胞相比較,結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中G6PD mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高,提示,G6PD在結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)。另外,與空白對(duì)照組、NC組相比,miR-335-5p mimic組G6PD mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低,提示miR-335-5p過表達(dá)可能通過降低G6PD表達(dá)影響SW480細(xì)胞增殖、凋亡。進(jìn)一步經(jīng)由生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.targetscan. org/vert_72/)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),G6PD是miR-335-5p的靶基因之一,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示,WT-miR-335-5p mimic+G6PD 3′-UTR組的熒光素酶相對(duì)活性低于WT-miR-335-5p NC+G6PD 3′-UTR組,提示miR-335-5p能夠靶向G6PD,調(diào)控其表達(dá)。
綜上所述,上調(diào)miR-335-5p可能通過靶向G6PD,抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,本研究不僅為結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制研究提供進(jìn)一步的參考,還在臨床治療或?yàn)榻Y(jié)腸癌的診斷提供理論依據(jù)以及潛在治療靶點(diǎn)有重要價(jià)值。但miR-335-5p可能存在多個(gè)靶基因,且結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡過程較為復(fù)雜,其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
Tab. 4 Overexpression of mir-335-5p on G6PD and apoptosis related proteins in SW480 n=6)