喙莢云實(shí)石油醚提取物對(duì)小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

劉 鑫，黃 聰，潘佳艷，黃勇其

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550002)

豆科(Fabaceac)云實(shí)屬(CaesalpiniaL.)植物全世界有100余種，中國(guó)有17種，主要分布在我國(guó)南部地區(qū)，藥用種類有14種，其中3種為國(guó)家及地方藥品標(biāo)準(zhǔn)收載品種，其他11種為民間用藥[1-4]。黔產(chǎn)云實(shí)屬藥用植物有6種，在民族醫(yī)藥廣為應(yīng)用，如：云實(shí)(C.deapetala)為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)收載品種，同時(shí)也是貴州常用的苗族藥，以根或根皮入藥[5]。目前，云實(shí)屬藥用植物的化學(xué)成份研究發(fā)現(xiàn)云實(shí)、蘇木(C.sappan)莖中主要含有黃酮類、二萜及其內(nèi)酯類、香豆素、酰胺、胡羅卜苷、β-谷甾醇、氨基酸、聯(lián)苯衍生物等[6-10]。本課題前期對(duì)喙莢云實(shí)莖葉和根各極性部位進(jìn)行了體外抗腫瘤活性研究，石油醚部位抗腫瘤活性最強(qiáng)，具有很高的成藥潛力。但是一般抗腫瘤成分通常都具有毒性，如果毒性過(guò)大，則制約了抗腫瘤成分的成藥性，因此本研究對(duì)黔產(chǎn)喙莢云實(shí)莖葉和根抗癌活性部位石油醚提取物急性毒性進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1 受試藥材與試劑 喙莢云實(shí)在4～5月采自貴州省冊(cè)亨縣，采回的藥材經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系何順志教授準(zhǔn)確鑒定為豆科云實(shí)屬蘇木喙莢云實(shí)(Caesalpiniaminax)。乙醇(EtOH)；石油醚(Pe)：AR分析純，沸點(diǎn)60～90℃，批號(hào)：20121019，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)[SCXU(渝)2007-0005]。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 電熱恒溫水浴鍋：HH·S21-4北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型；昆山市超聲儀器有限公司JA1003 型電子天平；BüCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-215瑞士步琪有限公司；循環(huán)水真空泵：SHZ-D(Ⅲ)鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司；電子調(diào)溫電熱套：98-1-B 10 000 ml天津泰斯特儀器有限公司；真空干燥箱：DZ-2BCⅡ天津泰斯特儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 喙莢云實(shí)石油醚提取物的制備 將采集藥材洗凈后陰干，粉碎成粗粉。稱取1 000 g喙莢云實(shí)粗粉(加10倍量的蒸餾水，煎煮3次每次1 h，過(guò)濾、合并濾液，減壓濃縮至3 000 ml)，分成2份，各1 500 ml并轉(zhuǎn)入3 000 ml分液漏斗中進(jìn)行萃取，基于相似相容的萃取原理，萃取所用的試劑極性不同，本實(shí)驗(yàn)采用一般萃取規(guī)則由小極性到大極性依次萃取，從而可以將總提物中的各個(gè)極性部位分離出來(lái)。將已制備好的濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分液漏斗洗凈后用適量真空油脂涂抹在活塞處，以防止漏液，按1∶1的比例量取石油醚進(jìn)行萃取；加入石油醚萃取時(shí)充分振搖，振搖3次后靜置待其分層，極性較小的一些脂溶性成分通過(guò)振搖后會(huì)充分溶于石油醚中，而水溶液及水溶液中的大極性物質(zhì)因?yàn)楦兔巡幌嗳芏a(chǎn)生分層，且位于下層，故而從分液漏斗下面放出水溶液，轉(zhuǎn)入燒杯中，備用；再?gòu)纳厦娴钩鍪兔演腿∫?，多次萃取直至石油醚萃取層至無(wú)色時(shí)合并石油醚萃取層，回收石油醚，將回收瓶中的萃取液轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，揮干，之后放入真空干燥箱內(nèi)真空干燥，密封袋保存于玻璃干燥器中標(biāo)記備用。

1.4.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)方法 預(yù)實(shí)驗(yàn)用昆明種18～22 g小鼠 36 只，隨機(jī)分為 6 組，每組 6 只，雌雄各半。腹腔注射(ip)給藥，測(cè)得 LD100=4 g/kg，LD0=1 g/kg。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步摸索出小鼠的死亡劑量，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，正式實(shí)驗(yàn)注射藥物濃度，分為4組，各組劑量間比值為 0. 7 分別為4.00 g/kg、2.80 g/kg、1.96 g/kg、1.37 g/kg，生理鹽水稀釋。

1.4.3 喙莢云實(shí)石油醚提取物半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定 采用改進(jìn)寇氏法。腹腔注射(ip)給藥。由4 g/kg開(kāi)始按1∶0.7比例等比稀釋得一系列的濃度供試液。取小白鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組10只，各組分別以不同濃度供試液按20 ml/kg給藥容量一次性ip給藥，觀察14 d，逐日記錄各組小鼠死亡數(shù)和中毒反應(yīng)。計(jì)算得喙莢云實(shí)石油醚提取物ip給藥LD50和95%可信限。

2 結(jié)果

2.1 小鼠中毒癥狀觀察 對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)及行為正常，體重增加。4組小鼠，大多狀態(tài)良好，行為活動(dòng)正常，部分出現(xiàn)活動(dòng)減少，四肢顫動(dòng)，小便失禁，呼吸困難，翻正反射消失，隨后死亡。1、2、3 組則大多停止進(jìn)食及飲水，一部分小鼠活動(dòng)量明顯減少、身體蜷縮并不斷抖動(dòng)、全身震顫等癥狀；一部分小鼠給藥后在籠內(nèi)上躥下跳，煩躁不安，啃咬鼠籠、精神亢奮、活動(dòng)增加。

2.2 喙莢云實(shí)石油醚提取物毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 統(tǒng)計(jì)給藥后14 d內(nèi)各組動(dòng)物死亡數(shù)，使用Bliss法計(jì)算喙莢云實(shí)石油醚提取物半數(shù)致死量。計(jì)算出喙莢云實(shí)石油醚提取物半數(shù)致死量LD50=1.961 g/kg；Feiller 法校正LD5095% 的可信限=1.650～2.330 g/kg；LD5=1.650 mg/kg，LD95=2.330 mg/kg。見(jiàn)表1。

表1 喙莢云實(shí)石油醚各組小白鼠用藥、死亡情況及計(jì)算(n=10，K=0.7)

2.3 小鼠各器官臟器重量 解剖各組小鼠，取臟器稱重。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 喙莢云實(shí)石油醚各組小白鼠臟器重量影響(n=10)

3 討論

貴州省擁有豐富的云實(shí)屬性植物資源，黔產(chǎn)云實(shí)屬藥用植物有 6 種，喙莢云實(shí)為其中之一，該植物資源豐富，其種子在民間用藥廣泛且療效顯著[5]。喙莢云實(shí)傳統(tǒng)用藥部位為種子，其具有良好的抗腫瘤作用，為探索喙莢云實(shí)的莖葉和根是否具有抗腫瘤作用，來(lái)擴(kuò)大藥用資源范圍。本課題組對(duì)云實(shí)屬植物具有較扎實(shí)的研究基礎(chǔ)，已完成的國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(39560088)“從國(guó)產(chǎn)云實(shí)屬植物中篩選替代進(jìn)口塔拉資源的研究”取得一定的研究成果。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，莖葉和根的石油醚部位有明顯的抑制腫瘤作用為其活性最強(qiáng)部位，其開(kāi)發(fā)成抗腫瘤藥物的潛力較大。但通?？鼓[瘤成分也有一定的毒性，因此在本研究中對(duì)喙莢云實(shí)莖葉和根石油醚提取物的急性毒性進(jìn)行研究。

在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)喙莢云實(shí)石油醚提取物的口服生物利用度很低，腹腔注射給藥效果很好，因此在本研究中采用腹腔注射給藥。在實(shí)驗(yàn)中最低劑量組的動(dòng)物行為大部分正常，而在其他組別中均出現(xiàn)活動(dòng)減少、抖動(dòng)、精神亢奮等異常狀態(tài)。在小鼠解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)，肝臟明顯腫大、淤血，其他臟器未見(jiàn)異常，由此可推測(cè)喙莢云實(shí)石油醚提取物的主要毒性在肝臟。半數(shù)致死量為L(zhǎng)D50=301.75 mg/kg，LD5095% 的可信限=1.650～2.330 g/kg。本研究的結(jié)果對(duì)云實(shí)屬植物資源的合理利用和抗癌新藥的開(kāi)發(fā)研究具有深遠(yuǎn)的意義。