高原低氧快速適應(yīng)人群篩選及其低氧適應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)研究*

李翠瑩 李小薇 肖軍 雷慧芬 孟方園 高瞻

高原具有低壓缺氧（其氧濃度僅為海平面的60%）、寒冷干燥等不利因素，會引起急進(jìn)高原的平原人員發(fā)生一系列生理或病理改變，主要表現(xiàn)在血紅蛋白代償性升高、血氧飽和度降低等，約75.7%的人群會出現(xiàn)輕中度高原反應(yīng)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肺水腫、腦水腫等疾病[1-2]。有研究提出在高原條件下，藏、漢族人群創(chuàng)傷休克時因失血、缺氧等因素導(dǎo)致其輸血策略不同：急進(jìn)高原人員輸血量是高原移居者的1.5倍，是高原藏族的2倍[3]?？梢?，高原條件的輸血策略具有與平原地區(qū)不同的特點(diǎn)。合理、有效的輸入血液成分及篩選高攜氧能力的紅細(xì)胞輸注是高原輸血治療的關(guān)鍵。

目前已知，血紅蛋白（hemoglobin，Hb）具有結(jié)合、貯存、運(yùn)輸和釋放氧的能力，但其結(jié)構(gòu)和功能的研究仍然是高原低氧醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，藏族基因突變頻率高于漢族，藏族血紅蛋白氧親和力高于漢族，動脈血氧飽和度接近平原地區(qū)，是長期自然選擇和進(jìn)化的結(jié)果，存在遺傳學(xué)因素的作用[4]。遺傳基因與低氧適應(yīng)密切相關(guān)，其中以低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）相關(guān)基因EPAS1、EGLN1和PPARA為主，其在遺傳水平影響著高原低氧環(huán)境的適應(yīng)性[5]。那么漢族是否存在快速適應(yīng)高原的優(yōu)勢基因型人群？平原漢族進(jìn)入高原后紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）及血紅蛋白變化規(guī)律等問題還有待進(jìn)一步研究。

本文針對平原漢族人群進(jìn)入高原后低氧習(xí)服適應(yīng)的變化規(guī)律及發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究，在藏、漢族人群高原適應(yīng)的差異研究基礎(chǔ)上，篩查高原低氧誘導(dǎo)因子相關(guān)基因及高氧親和力血紅蛋白F（HbF）分型的人群，選擇高表達(dá)低氧適應(yīng)相關(guān)基因及其高攜氧能力的紅細(xì)胞，篩選高原低氧快速適應(yīng)人群。

對象與方法

1 研究對象 采集平原漢族（海拔50～500米）、進(jìn)駐高原（海拔2 500～3 000米、3 700～4 600米）3天、7天、30天、90天、久居高原（＞10年）漢族及世居高原藏族血液樣本742份，進(jìn)行藏、漢族人群高原適應(yīng)的差異研究。所有受試者均簽署知情同意書，并通過個人調(diào)查，排除相互之間的血緣關(guān)系。該項(xiàng)目通過倫理審批，審批號：空總（科研）第2017-16-YJ01。

2 研究方法

2.1 血常規(guī)及血氧飽和度檢測：根據(jù)世居平原漢族（海拔50～500米）、急進(jìn)高原3天（海拔2 500～3 000米）和7天漢族（海拔3 700～4 600米）、高原低氧習(xí)服訓(xùn)練30天漢族（海拔3 700米）、高原低氧習(xí)服訓(xùn)練90天漢族（海拔3 700米）、世居高原藏族（海拔3 700米）及久居高原漢族（海拔3 700米居?。?0年）進(jìn)行分組，采用全自動血細(xì)胞分析儀和血氧飽和度檢測儀測定不同分組血液樣本的血常規(guī)及血氧飽和度SpO2數(shù)據(jù)。

2.2EPAS1、EGLN1和PPARA基因mRNA表達(dá)水平檢測：對上述分組人群的血液樣本提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；設(shè)計(jì)3個基因的實(shí)時定量PCR引物，SYBR Green法檢測3個基因mRNA表達(dá)量，明確不同分組人群中高原低氧適應(yīng)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的差異。

2.3 高氧親和力HbF分析：根據(jù)上述分組，平原漢族、久居高原漢族及世居高原藏族中每組20例，采用蛋白電泳方法分析高氧親和力HbF差異，操作步驟參照試劑盒說明書。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0進(jìn)行不同分組人群血常規(guī)及SPO2的差異分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用Dunnett't分析；重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量方差分析，多重比較采用Bonferroni方法進(jìn)行校正；不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同分組人群中生理指標(biāo)的檢測結(jié)果 與平原漢族男性對比，急進(jìn)高原3天、7天、高原習(xí)服訓(xùn)練30天、90天及久居高原漢族血紅蛋白濃度顯著升高，世居高原藏族Hb濃度略有升高（表1、表2）；平原漢族進(jìn)入高原后血氧飽和度（SpO2）顯著降低，世居高原藏族SpO2與平原漢族比較略有降低（圖1）。

2 其他血液指標(biāo)變化 ①紅細(xì)胞與紅細(xì)胞壓積（Hct）：與平原漢族男性比較，進(jìn)入高原后（3天、7天、30天、90天）、久居高原漢族及藏族均顯著升高；②白細(xì)胞（white blood cell，WBC）：平原漢族男性進(jìn)入高原后升高，藏族及久居高原漢族男性高于平原漢族；③血小板（platelet，PLT）：平原漢族男性進(jìn)入高原后升高，藏族男性明顯高于平原漢族和久居高原漢族（表1、表2）。

表2 同一組人員進(jìn)入高原前后血常規(guī)各參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（ ±s）

3 血液SpO2結(jié)果 與平原漢族SpO2（9 4～9 9%，97.28±1.46%）對比，急進(jìn)高原3天SpO2（79～93%，8 7.6±3.1%）顯著降低，高原習(xí)服3 0天SpO2（85～95%，90.4±2.6%）有所升高，但仍低于平原漢族；久居高原組SpO2（80～95%，87.7±5.6%）與急進(jìn)高原3天數(shù)據(jù)接近，藏族SpO2（89～100%，94.5±2.5%）仍低于平原，但高于其他分組（圖1）。

圖1 不同分組人群中血氧飽和度SpO2的差異

4 高原低氧適應(yīng)相關(guān)基因EPAS1、EGLN1及PPARA的mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果 平原漢族進(jìn)入高原3天及7天EPAS1基因表達(dá)升高，激活下游EPO等靶基因轉(zhuǎn)錄，增加機(jī)體血紅蛋白含量；EGLN1和PPARA基因急進(jìn)高原3天時表達(dá)顯著降低，減少對EPAS1基因表達(dá)的抑制，促進(jìn)其下游靶基因轉(zhuǎn)錄，高原習(xí)服訓(xùn)練30天3個基因表達(dá)水平達(dá)到平衡；高原習(xí)服90天及久居高原漢族3個基因的表達(dá)水平均顯著高于世居平原漢族，世居高原藏族EPAS1及PPARAmRNA表達(dá)水平高于世居平原漢族，與其血紅蛋白含量高于平原漢族結(jié)果相一致（圖2）。同時，分析了平原漢族進(jìn)入高原3天EPAS1基因表達(dá)升高與未升高人員的高原前后血常規(guī)參數(shù)變化情況，EPAS1基因表達(dá)未升高人員進(jìn)入高原后RBC、Hb及Hct變化明顯高于升高人員（表3）。

圖2 不同分組人群中EPAS1、EGLN1及PPARA基因表達(dá)水平

表3 EPAS1基因表達(dá)明顯變化人員高原前后血常規(guī)各參數(shù)差值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（ ±s）

5 不同分組人群中高氧親和力HbF分析 蛋白電泳檢測高氧親和力H b F差異：正常成人血紅蛋白HbA≥96.5%，HbF＜2.0%，HbA2≤3.5%，而嬰兒血紅蛋白HbF 60%～93%，HbA2＜1%，其中HbF具有更高的氧親和力。對不同分組人群中血紅蛋白進(jìn)行電泳發(fā)現(xiàn)，世居高原藏族人群中54.5% HbF電泳陽性，久居高原漢族人群中27.3% HbF電泳陽性，平原漢族人群中僅有14.3% HbF電泳陽性（圖3）。

圖3 高原低氧環(huán)境下不同分組中血紅蛋白分型的差異

討 論

高原低氧環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克是高原醫(yī)學(xué)救治的難點(diǎn)，主要存在兩方面問題，一方面是救治困難、死亡率高，因高原低壓缺氧等特殊環(huán)境導(dǎo)致機(jī)體失血耐受能力低、液體耐受能力小、多器官衰竭發(fā)生早，救治效果差，死亡率顯著高于平原[2]；另一方面是高原輸血策略與平原地區(qū)不同，平原漢族急進(jìn)高原失血性休克的輸血量是藏族的2倍，大量輸血導(dǎo)致血流減緩，加重組織缺氧，不利于救治[3]。因此，合理、有效的輸入高攜氧能力血液成分是高原輸血治療的關(guān)鍵。

近年來國際頂尖雜志Science、Nature、Cell等發(fā)表的多篇文章表明，關(guān)于藏漢族高原耐缺氧機(jī)制的研究多集中在低氧誘導(dǎo)因子相關(guān)基因以及紅細(xì)胞攜釋氧功能研究等[6-8]。通過本研究，明確了進(jìn)入高原后紅細(xì)胞及血紅蛋白的變化規(guī)律。項(xiàng)目組研究發(fā)現(xiàn)高原低氧對機(jī)體血液參數(shù)產(chǎn)生較大影響，甚至影響機(jī)體免疫功能。平原漢族進(jìn)入高原后機(jī)體通過增加RBC及Hb水平以滿足各個組織器官的氧供，而這種變化也增加了血液粘度，伴隨著PLT計(jì)數(shù)升高，可能增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)；而且在高原低氧條件下，WBC亦升高，提示機(jī)體免疫功能也可能出現(xiàn)紊亂。針對前述問題，則需篩選快速適應(yīng)高原的平原人群，并對其進(jìn)行低氧習(xí)服訓(xùn)練，以更快適應(yīng)極端的低氧環(huán)境，而不出現(xiàn)嚴(yán)重的高原反應(yīng)[9]。因此，本項(xiàng)目前期在平原漢族男性中篩選出EPAS1基因rs13419896和rs1868092位 點(diǎn)A-A優(yōu) 勢 單 體 型，EGLN 1基 因rs 1 2 0 9 7 9 0 1和rs2790859位點(diǎn)G-C優(yōu)勢單體型，攜帶上述高原優(yōu)勢單體型的人群可快速習(xí)服適應(yīng)高原[10-11]。

關(guān)于低氧誘導(dǎo)因子相關(guān)3個基因mRNA表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn)平原漢族急進(jìn)高原后EPAS1基因表達(dá)水平顯著升高，EGLN1基因、PPARA基因表達(dá)具有相應(yīng)的變化規(guī)律。分析原因：①EPAS1編碼低氧誘導(dǎo)因子HIF-2α，作為低氧誘導(dǎo)因子的主要成分之一，高原低氧環(huán)境刺激其表達(dá)升高是高原習(xí)服的表現(xiàn)，其可激活下游EPO等靶基因轉(zhuǎn)錄，增加RBC計(jì)數(shù)及Hb含量適應(yīng)高原。因此我們認(rèn)為進(jìn)入高原后EPAS1基因表達(dá)量高于平原的人群利于機(jī)體紅細(xì)胞生成，使高原低氧機(jī)體紅細(xì)胞造血達(dá)到平衡，避免過多的紅細(xì)胞產(chǎn)生，可快速習(xí)服高原的適應(yīng)人群。②EPAS1及PPARA負(fù)調(diào)控HIF-2α，平原進(jìn)入高原3天表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而減少對HIF-2α表達(dá)的抑制，促進(jìn)HIF下游EPO等靶基因的表達(dá)，促進(jìn)紅細(xì)胞生成及成熟，利于高原習(xí)服適應(yīng)。本研究分析發(fā)現(xiàn)平原漢族急進(jìn)高原3天EPAS1基因表達(dá)未升高人員進(jìn)入高原后RBC、Hb及Hct變化明顯高于基因表達(dá)升高人員，提示EPAS1基因表達(dá)未升高人員進(jìn)入高原后可能存在血液粘度顯著升高，不利于高原低氧習(xí)服。因此，篩選進(jìn)入高原3天EPAS1基因表達(dá)升高人員可利于平原漢族的高原低氧習(xí)服適應(yīng)。

項(xiàng)目組通過蛋白電泳檢測發(fā)現(xiàn)，世居高原藏族高氧親和力血紅蛋白分型HbF含量最高，其次是久居高原漢族，平原漢族中最少。藏族人群血液中高氧親和力HbF含量高，說明其動脈血氧飽和度相對較高，這與藏族SPO2高于急進(jìn)高原組和高原習(xí)服組結(jié)果一致（圖1）。而本研究中久居高原組HbF比例比平原漢族多，但是高原地區(qū)久居高原組SPO2卻低于高原習(xí)服組，分析原因可能是該組人員數(shù)量較少。這與項(xiàng)目組前期平原漢族、急進(jìn)高原、高于習(xí)服、久居高原漢族及高原藏族人群的紅細(xì)胞攜釋氧功能P50[12-13]及拉曼光譜測定血紅蛋白結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致[14-15]。因此，世居平原漢族急進(jìn)高原初期主要通過RBC計(jì)數(shù)、Hb含量增加及RBC釋放氧功能增加保證機(jī)體供氧；隨著進(jìn)駐高原時間的延長，RBC與氧的親和力逐漸增加產(chǎn)生高原習(xí)服；世居高原藏族RBC計(jì)數(shù)及Hb含量略高于平原，其對高原適應(yīng)主要源于紅細(xì)胞與氧的親和力強(qiáng)，滿足機(jī)體各個組織及器官供氧。

綜上所述，本研究對世居高原藏族、世居平原漢族、急進(jìn)高原3天及7天、高原習(xí)服30天及90天、久居高原漢族人群分組，開展高原適應(yīng)人群的篩選研究，篩選出進(jìn)入高原EPAS1基因表達(dá)升高的人群，具有高攜氧能力紅細(xì)胞HbF的人群，為高原低氧適應(yīng)人群的選拔提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突