拮抗菌HT-6對(duì)致病疫霉的競(jìng)爭(zhēng)及誘導(dǎo)性抑制

蔣繼志，張聰穎，梁嬌，喬柳，孟翠麗

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2. 邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河北 邢臺(tái) 054000)

植物病害生物防治因具有低毒、高效、環(huán)境友好等特性，越來越受到學(xué)者們的關(guān)注，細(xì)菌因其種類多、繁殖快、易于存活等特點(diǎn)而更顯優(yōu)勢(shì)[1-2].生防細(xì)菌的抑菌機(jī)理主要有空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)[3]、誘導(dǎo)植物抗性[4]、自發(fā)產(chǎn)生抑菌物質(zhì)[5]、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[6]等方式，其中通過空間競(jìng)爭(zhēng)和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)是眾多生防細(xì)菌抑制植物病原菌的重要方式之一[3,7]，部分拮抗菌能同時(shí)借助多種方式抑制植物病原菌.王智榮等[7]發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)ZX既可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，又可通過對(duì)葡萄糖、果糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用優(yōu)勢(shì)抑制病原菌指狀青霉(Penicilliumdigitatum)的生長(zhǎng)；虢雅潔等[8]報(bào)道淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)PLF-1能誘導(dǎo)百合種球?qū)怄哏牭毒?Fusariumoxysporum)的抗性，主要是增強(qiáng)植株中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性，有效減輕尖孢鐮刀菌的毒害作用，并促進(jìn)植株健康生長(zhǎng)，同時(shí)還能有效抑制尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)，抑制率高達(dá)72%.

關(guān)于致病疫霉(Phytophthorainfestans)拮抗細(xì)菌的抑制機(jī)理，當(dāng)前主要集中于拮抗菌自身產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)及誘導(dǎo)植物抗性與促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面.林睿[9]研究表明供試的8株致病疫霉拮抗放線菌均可以產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)，且具有解磷能力、產(chǎn)脲酶能力，可以分解土壤中的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)馬鈴薯植株的生長(zhǎng)；馬強(qiáng)[10]發(fā)現(xiàn)弱小珊瑚球菌E10(Corallococcusexiguous)和珊瑚狀珊瑚球菌E10(C.coralloides)的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有比較高的抗致病疫霧活性；王游游[11]證明枯草芽孢桿菌WL-2可以產(chǎn)生Iturin A和Surfactin兩類脂肽物質(zhì)來抑制致病疫霉，并且該菌株對(duì)馬鈴薯植株具有良好的促生作用.迄今為止，對(duì)于拮抗細(xì)菌是否通過營(yíng)養(yǎng)與空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)或通過競(jìng)爭(zhēng)作用與其他抑菌作用協(xié)同抑制致病疫霉鮮見報(bào)道.

HT-6菌株是本研究室前期從西藏林芝核桃樹病葉中分離出的1株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其菌液對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的抑制作用(抑菌率為89.22%)[12]，并能使菌絲體形態(tài)發(fā)生畸變，但無菌體發(fā)酵濾液沒有抑菌作用[13]，同時(shí)在HT-6菌液和致病疫霉菌落之間沒有觀察到明顯且很寬的抑菌帶，推測(cè)HT-6的抑菌作用可能依賴于細(xì)菌的快速生長(zhǎng).另外，本研究室張紅霞等[14]發(fā)現(xiàn)HT-6菌株經(jīng)致病疫霉誘導(dǎo)(對(duì)峙培養(yǎng))后能產(chǎn)生纖維素酶(活力為8.141 U)，且該纖維素酶可引起致病疫霉菌絲體形態(tài)發(fā)生明顯畸變(畸變率為23%)，而HT-6菌株單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)不產(chǎn)生纖維素酶.由于致病疫霉細(xì)胞壁中主要含有纖維素和葡聚糖等結(jié)構(gòu)物質(zhì)，菌絲體生長(zhǎng)受阻尤其是形態(tài)發(fā)生畸變，可能是細(xì)胞壁中的纖維素和葡聚糖等發(fā)生了變化.因此，本實(shí)驗(yàn)擬證實(shí)HT-6菌株對(duì)致病疫霉的營(yíng)養(yǎng)或空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)作用，同時(shí)探討致病疫霉菌體和菌絲體細(xì)胞壁制劑對(duì)HT-6產(chǎn)生纖維素酶和葡聚糖酶的影響，并明確HT-6對(duì)致病疫霉的競(jìng)爭(zhēng)作用和致病疫霉誘導(dǎo)HT-6產(chǎn)生抗菌物質(zhì)在抑制致病疫霉菌絲生長(zhǎng)中的相互關(guān)系，為進(jìn)一步闡明HT-6菌株的拮抗機(jī)制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌株和供試培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌HT-6(Bacillussubtilis)為河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物病理研究室從西藏林芝核桃樹病葉中分離得到的1株內(nèi)生細(xì)菌.致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary]W101菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株(黑麥培養(yǎng)基斜面14 ℃培養(yǎng)箱黑暗保存).

黑麥固體培養(yǎng)基(Rye)、黑麥液體培養(yǎng)基(RL)、LB液體培養(yǎng)基(LBL)、LB固體培養(yǎng)基(LB)、苯胺藍(lán)葡聚糖酶檢測(cè)培養(yǎng)基(ABG)、剛果紅纖維素培養(yǎng)基(CRC)、CAS固體培養(yǎng)基(CAS)、化學(xué)合成培養(yǎng)基(LSM：MgSO4·7H2O, 0.2 g；NH4NO3, 1.0 g；K2HPO4, 0.9 g；KCl, 0.15 g；FeCl2，0.002 g；ZnSO4, 0.002 g；葡萄糖, 5.0 g；蒸餾水1 000 mL).

1.2 HT-6與致病疫霉空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)的測(cè)定

參考Ohtsu[15]的方法并作如下改進(jìn)，在Rye平板上放置1個(gè)瓊脂柱(PDA培養(yǎng)基，d=10 mm，h=2 mm)，將HT-6菌餅(d=9 mm)經(jīng)LB培養(yǎng)24 h后置于瓊脂柱上表面，再取經(jīng)Rye培養(yǎng)7 d的致病疫霉菌餅(d=9 mm)置于HT-6菌餅上，20 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，以瓊脂柱上不接HT-6只接致病疫霉菌餅做為對(duì)照，觀察記錄HT-6及致病疫霉在瓊脂柱及Rye表面的生長(zhǎng)情況.

1.3 HT-6與致病疫霉?fàn)I養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)的檢測(cè)

1.3.1 產(chǎn)生嗜鐵素的檢測(cè)

參照余賢美[16]的方法觀察HT-6和致病疫霉是否產(chǎn)生嗜鐵素，取150 μL HT-6菌液加入CAS平板上的孔中(d=9 mm)，以接種150 μL LBL作為對(duì)照，30 ℃黑暗培養(yǎng)3 d；取致病疫霉(d=9 mm)菌餅置于CAS平板上，以接種空白R(shí)ye瓊脂塊作為對(duì)照，20 ℃黑暗培養(yǎng)3 d；分別觀察CAS平板上HT-6和致病疫霉菌落邊緣是否產(chǎn)生橘黃色暈圈，判斷是否產(chǎn)生嗜鐵素.

1.3.2 競(jìng)爭(zhēng)葡萄糖的檢測(cè)

按照邵江濤等[17]的方法，在150 mL LSM中加入3個(gè)HT-6菌餅(d=9 mm)后37 ℃、150 r/min培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)液經(jīng)離心(6 000 r/min，5 min)、過濾(0.22 μm)得到無菌體發(fā)酵液；同樣在150 mL LSM中加入3個(gè)致病疫霉菌餅(d=9 mm)后20 ℃黑暗條件下靜置培養(yǎng)5 d，離心及過濾同HT-6無菌發(fā)酵液的制備，得到致病疫霉無菌體發(fā)酵液；采用硫酸-蒽銅法[18]測(cè)定2種無菌體發(fā)酵液中剩余葡萄糖含量，利用葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線與空白LSM培養(yǎng)液中葡萄糖的含量相比，得到細(xì)菌HT-6及致病疫霉的葡萄糖利用率.

1.3.3 競(jìng)爭(zhēng)硝態(tài)氮的檢測(cè)

1.4 致病疫霉活體誘導(dǎo) HT-6產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的檢測(cè)

取在Rye上活化培養(yǎng)了7 d的致病疫霉菌餅(d=9 mm)置于新鮮的Rye平板一側(cè)，將在LB上涂布培養(yǎng)24 h的HT-6菌餅(d=9 mm)置于距離致病疫霉菌餅邊緣30 mm處，20 ℃黑暗靜置培養(yǎng)3 d，取兩菌落之間的無菌體瓊脂塊(DCB，d=9 mm)，按照張紅霞等[14]的方法，分別在ABG及CRC培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，觀察有無透明圈出現(xiàn)，從而判斷有無β-1,3-葡聚糖酶和纖維素酶產(chǎn)生，并用DNS法[14]測(cè)定酶活，同時(shí)單獨(dú)培養(yǎng)HT-6菌株，打取其菌落周圍的無菌體瓊脂塊(d=9 mm)作為對(duì)照.

1.5 致病疫霉菌絲體細(xì)胞壁制劑(CWP)誘導(dǎo)HT-6產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的檢測(cè)

參照李永才等[20]的方法并作如下改進(jìn)制備菌絲體CWP，在新鮮Rye表面緊貼放置滅過菌的玻璃紙，取培養(yǎng)了7 d的致病疫霉菌餅放于玻璃紙上，20 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，用無菌牙簽刮取菌絲體，經(jīng)無菌蒸餾水和PBS緩沖液沖洗、300目(孔徑0.05 mm)篩網(wǎng)過濾后收集菌絲體，取2 g菌絲體溶于100 mL無菌蒸餾水中于組織搗碎機(jī)中勻漿，得到致病疫霉菌絲體CWP；分別取3、6、9、12、15 mL CWP加入LBL中，得到CWP質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/L的溶液，再向其中接種經(jīng)LBL活化培養(yǎng)24 h的HT-6菌液原液200 μL(OD600=1.433)，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液經(jīng)離心(6 000 r/min，5 min)和過濾(0.22 μm)后，得到CWP誘導(dǎo)后的HT-6無菌體發(fā)酵液，按照1.4節(jié)中的方法分別檢測(cè)其中β-1,3-葡聚糖酶和纖維素酶的活力.

1.6 CWP誘導(dǎo)后無菌發(fā)酵液抑制致病疫霉菌絲生長(zhǎng)活性的檢測(cè)

采用打孔法及平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定經(jīng)CWP誘導(dǎo)后的HT-6無菌發(fā)酵液對(duì)致病疫霉的抑菌活性[14].在新鮮Rye平板中央接種培養(yǎng)7 d的致病疫霉菌餅(d=9 mm)，菌餅兩側(cè)對(duì)稱打孔(d=9 mm)，孔中滴加適宜質(zhì)量濃度CWP誘導(dǎo)后的HT-6無菌發(fā)酵液200 μL(濃縮10倍)，20 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，以LBL、HT-6無菌體發(fā)酵液及單獨(dú)培養(yǎng)的HT-6菌液原液分別作為對(duì)照，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，統(tǒng)計(jì)抑菌率，并挑取受抑制的致病疫霉菌落邊緣的菌絲體，鏡檢觀察菌絲體的畸變情況并計(jì)算畸變率[14].

抑菌率=(對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑)/(對(duì)照菌落半徑-菌餅半徑)×100%，

畸變率= 發(fā)生畸變的菌絲(段)數(shù) / 總菌絲(段)數(shù)×100%.

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel(2020)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后經(jīng)Origin(8.0)軟件在P<0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 HT-6與致病疫霉對(duì)空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)

采用空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HT-6與致病疫霉的生長(zhǎng)速率(mm/d)，結(jié)果如圖1所示.致病疫霉菌餅與HT-6菌餅在PDA瓊脂柱上對(duì)接培養(yǎng)后，HT-6越過瓊脂柱并在Rye表面迅速生長(zhǎng)，至第7天菌落半徑可達(dá)20.0 mm，生長(zhǎng)速率為2.8 mm/d(圖1a-g)，對(duì)接培養(yǎng)中的致病疫霉僅在菌餅周圍和上方長(zhǎng)出很少量菌絲，沒有擴(kuò)展到Rye表面，基本被HT-6菌落抑制，而對(duì)照瓊脂柱上致病疫霉在第3天開始快速生長(zhǎng)，至第7天時(shí)菌絲體已布滿Rye表面，菌落半徑達(dá)42.0 mm，生長(zhǎng)速率達(dá)到6.0 mm/d(圖1a1-g1).表明細(xì)菌HT-6可以通過自身的迅速生長(zhǎng)占據(jù)空間位點(diǎn)，從而抑制致病疫霉菌絲的生長(zhǎng).

a-g.HT-6與致病疫霉對(duì)接培養(yǎng)1～7 d的結(jié)果；a1-g1.單獨(dú)接種致病疫霉培養(yǎng)1～7 d的結(jié)果.圖1 細(xì)菌HT-6與致病疫霉在PDA瓊脂柱上對(duì)接后對(duì)空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)Fig.1 Competition between HT-6 strain and P. infestans in special position on agar column

2.2 HT-6與致病疫霉對(duì)營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)

a.HT-6菌液；b.LBL；c.致病疫霉菌餅.圖2 HT-6與致病疫霉產(chǎn)生嗜鐵素的檢測(cè)Fig.2 Siderophore in HT-6 strain and P. infestans was detected by chrome azurol sulphonate medium

2.3 致病疫霉誘導(dǎo)對(duì)HT-6產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶和纖維素酶的影響

致病疫霉菌餅與HT-6菌餅對(duì)峙培養(yǎng)7 d后，將兩菌落之間的無菌體瓊脂塊(DCB)分別轉(zhuǎn)移至CRC和ABG培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)3 d，發(fā)現(xiàn)該瓊脂塊在CRC(圖3a)和AGB(圖3b)上均有明顯的透明圈出現(xiàn)，而單獨(dú)培養(yǎng)HT-6菌落周圍的無菌體瓊脂塊在CRC(圖3a)和AGB(圖3b)上均沒有觀察到明顯的透明圈出現(xiàn)，說明HT-6在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)不產(chǎn)生纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶，但受致病疫霉活體或其分泌的某種成分誘導(dǎo)或刺激后產(chǎn)生了這2種酶.進(jìn)一步用DNS法測(cè)得DCB中纖維素酶的活力為6.638 U，β-1,3-葡聚糖酶的活力為2.913 U.

a-b.HT-6與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)之間的無菌體瓊脂塊；c-d.單獨(dú)培養(yǎng)HT-6后的無菌體瓊脂塊.圖3 HT-6與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)后產(chǎn)生纖維素酶及β-1，3-葡聚糖酶的檢測(cè)Fig.3 Detection of cellulase and β-1，3-glucanase after dual culture of HT-6 strain and P. infestans

2.4 CWP誘導(dǎo)對(duì)HT-6產(chǎn)生纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶的影響

利用DNS法檢測(cè)了不同質(zhì)量濃度CWP誘導(dǎo)后HT-6無菌體發(fā)酵液中纖維素酶及β-1,3-葡聚糖酶的活性，結(jié)果如圖4所示.總體上來看，隨著供試CWP質(zhì)量濃度的增加，誘導(dǎo)后的HT-6無菌發(fā)酵液中纖維素酶活先急劇上升而后顯著下降，β-1,3-葡聚糖酶活則先上升而后基本保持不變；2種酶活均在CWP為1.2 g/L時(shí)達(dá)到最高且彼此比較接近，分別為1.326、1.289 U，但在其他質(zhì)量濃度條件下，β-1,3-葡聚糖酶活均遠(yuǎn)高于纖維素酶活；在1.2 g/L CWP質(zhì)量濃度下的纖維素酶活與其他時(shí)間段均達(dá)到顯著性差異(P<0.05)，而1.2 g/L CWP質(zhì)量濃度下的β-1,3-葡聚糖酶活僅與0.4、0.8 g/L CWP質(zhì)量濃度下的酶活有顯著性差異.

不同小寫字母及帶上標(biāo)小寫字母分別表示纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶酶活在0.05水平上差異顯著.圖4 CWP誘導(dǎo)后HT-6無菌發(fā)酵液中纖維素酶及β-1，3-葡聚糖酶的活性Fig.4 Activities of cellulase and β-1，3-glucanase in HT-6 free cell fermentation liquid after CWP induction

2.5 CWP誘導(dǎo)后無菌發(fā)酵液對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制活性

由于單獨(dú)培養(yǎng)HT-6后的無菌體發(fā)酵液對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)沒有抑制作用，利用平板打孔法檢測(cè)了1.2 g/L CWP誘導(dǎo)培養(yǎng)HT-6后的無菌體發(fā)酵液對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的影響(圖5).結(jié)果顯示，LBL和單獨(dú)培養(yǎng)HT-6的無菌體發(fā)酵液均沒有抑制作用，而CWP誘導(dǎo)后的HT-6無菌發(fā)酵液展現(xiàn)出了顯著的抑制活性，抑菌率達(dá)到33.25%，與LBL以及單獨(dú)培養(yǎng)HT-6的無菌體發(fā)酵液之間均有顯著性差異(P<0.05)，但與單獨(dú)培養(yǎng)的HT-6菌液原液作為陽(yáng)性對(duì)照(抑菌率81.33%)相比，抑菌活性要低很多，兩者之間達(dá)到顯著性差異(P<0.05).表明本來對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)沒有抑制作用的HT-6無菌體發(fā)酵液，經(jīng)CWP誘導(dǎo)后變得有抑菌作用了，推測(cè)CWP誘導(dǎo)后HT-6產(chǎn)生的纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶發(fā)揮了抑菌作用，但抑菌活性顯著低于HT-6菌液原液，表明CWP誘導(dǎo)后HT-6產(chǎn)生的纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶在抑制致病疫霉菌絲生長(zhǎng)過程中并不起主要作用，同時(shí)暗示在HT-6菌液中可能還有其他參與抑制致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的物質(zhì)存在或HT-6菌株尚有其他抑菌方式存在.

a.CWP誘導(dǎo)后的HT-6無菌體發(fā)酵液；b.單獨(dú)培養(yǎng)的HT-6菌液；c.單獨(dú)培養(yǎng)HT-6的無菌體發(fā)酵液；d.LBL.圖5 CWP誘導(dǎo)培養(yǎng)后的HT-6無菌發(fā)酵液對(duì)致病疫霉菌絲體生長(zhǎng)的抑制Fig.5 Inhibition of HT-6 free cell fermentation liquid after CWP induction on P. infestans mycelial growth

進(jìn)一步挑取致病疫霉菌絲體鏡檢，觀察到經(jīng)CWP誘導(dǎo)后的HT-6無菌發(fā)酵液可使部分菌絲體發(fā)生畸變，畸變率約為29.58%，主要有粗細(xì)不一、扭曲、折疊、表面凸起增多、分枝增多、內(nèi)含物分布不均勻或溢出等現(xiàn)象(圖6a-c)，與受HT-6菌液抑制后的菌絲體形態(tài)發(fā)生畸變相似(畸變率約為43.2%)(圖6d)，而正常菌絲體粗細(xì)均勻，光滑直順，內(nèi)含物飽滿且分布均勻(圖6e).

a-c.CWP誘導(dǎo)后的HT-6無菌發(fā)酵液處理的菌絲;d.HT-6菌液處理的菌絲;e.單獨(dú)培養(yǎng)的正常菌絲.a.含物流出；b.粗細(xì)不一，凸起增多；c.扭曲折疊;d.內(nèi)含物分布不均勻.圖6 CWP誘導(dǎo)后HT-6無菌發(fā)酵液對(duì)致病疫霉菌絲體的影響Fig.6 Effect of HT-6 free cell fermentation liquid after CWP induction on P. infestans mycelia

3 討論

空間位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)是生防菌拮抗病原菌的重要作用機(jī)理之一[3]，一種生物如果能夠優(yōu)于其他生物優(yōu)先占據(jù)空間并快速、有效地利用該空間中的各種營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)定殖, 則能使自身更好地生存、繁殖或傳播[16].郭榮君等[21]將枯草芽孢桿菌B006和B010分別與大豆尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮鐮刀菌 (F.solani)W1對(duì)接培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)這2株細(xì)菌均可優(yōu)先在瓊脂柱表面生長(zhǎng)并迅速在培養(yǎng)基平板上擴(kuò)展，完全覆蓋病原菌，且病菌菌絲被破壞，無法形成菌落，他們推測(cè)如果這2株拮抗菌以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)為主，則自身不會(huì)在培養(yǎng)基表面迅速生長(zhǎng)并擴(kuò)展，因而認(rèn)為這2株細(xì)菌主要是通過空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)發(fā)揮抑菌作用[22]；Celar等[22]比較了生防木霉菌與多種植物病原菌(F.solani,F.sambucinum,F.moniliforme等) 之間對(duì)硝態(tài)氮的利用情況，發(fā)現(xiàn)分別培養(yǎng)6 d后，生防木霉菌對(duì)硝態(tài)氮的利用率高達(dá)100%，而供試的幾種鐮刀菌的利用率為60%～75%，均顯著低于前者，認(rèn)為木霉菌主要通過營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)抑制上述植物病原菌.此外，在拮抗菌與植物病原菌相互作用中，病原菌的某些成分可作為激發(fā)子誘導(dǎo)拮抗菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，陳剛等[23]收集植物病原菌尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、立枯絲核菌(R.solani)和稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)的菌絲，清洗并以濾紙過濾，然后將菌絲體用 120 ℃滅活10 min，再用液氮研磨至粉末，得到細(xì)胞壁制劑(CWP)，并以10 g/L的CWP對(duì)生防菌球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前球毛殼菌產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶的能力幾乎為0，誘導(dǎo)后產(chǎn)酶能力顯著增強(qiáng)，3種病菌的CWP誘導(dǎo)后最高酶活力分別為0.19、0.31和0.61 U；殷福嬌[24]以華山松皰銹病菌(Cronartiumribicola)的銹孢子壁CWP誘導(dǎo)木霉菌(Trichodermaspp.)LS020和SS003菌株后，2種菌所產(chǎn)的β-1,3-葡聚糖酶活性均顯著增強(qiáng)，其中LS020菌株中酶活由1.71 U升至3.58 U，SS003菌株中酶活由2.08 U升至4.16 U.

本研究中致病疫霉菌餅與細(xì)菌HT-6菌餅對(duì)接培養(yǎng)后，致病疫霉菌絲被HT-6強(qiáng)烈抑制，基本無法生長(zhǎng)，而HT-6可以正常生長(zhǎng)并在培養(yǎng)基表面迅速蔓延，表明細(xì)菌HT-6在空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)方面占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與郭榮君等[22]報(bào)道的枯草芽孢桿菌B006和B010主要是通過空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)抑制大豆尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的結(jié)果一致；同時(shí)，致病疫霉不產(chǎn)生嗜鐵素，而HT-6可以產(chǎn)生嗜鐵素來優(yōu)先利用環(huán)境中的鐵，即可以通過在根際中螯合鐵來抑制植物病原體的生長(zhǎng)(抑菌率為89.22%)[12]，這與余賢美等[15]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌CAS15可以分泌嗜鐵素來抑制稻瘟病菌、尖孢鐮刀菌等15種病原菌的結(jié)果相一致(抑制率均高于88%)；HT-6對(duì)于葡萄糖和硝酸鹽的利用率均顯著高于致病疫霉，這與Celar等[22]對(duì)生防木霉菌與幾種植物病原菌競(jìng)爭(zhēng)硝態(tài)氮的研究結(jié)果一致.此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)HT-6經(jīng)致病疫霉菌體和CWP誘導(dǎo)后均可產(chǎn)生纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶，只是菌體誘導(dǎo)后產(chǎn)生的2種酶活顯著高于CWP的誘導(dǎo)，而HT-6菌株單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)不產(chǎn)生這2種酶；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)本來對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)無抑制作用的HT-6菌株無菌體發(fā)酵液，經(jīng)CWP誘導(dǎo)后對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)有了較強(qiáng)的抑制作用，可能是誘導(dǎo)后HT-6無菌體發(fā)酵液中的纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶發(fā)揮了抑菌作用.以上結(jié)果表明細(xì)菌HT-6既可通過空間與營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)又可通過致病疫霉的誘導(dǎo)而產(chǎn)生胞壁降解酶來協(xié)同抑制致病疫霉，其中以空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)抑制病菌為主.這為深入理解HT-6對(duì)致病疫霉的抑制機(jī)理提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也暗示細(xì)菌HT-6在未來防治馬鈴薯晚疫病中應(yīng)根據(jù)病害發(fā)生發(fā)展情況預(yù)先施用才會(huì)有更好的效果.因此，利用細(xì)菌HT-6在田間實(shí)際防治馬鈴薯晚疫病的實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)盡快開展.