全基因組測序在山羊上的研究進展

李 恒，字向東

（西南民族大學動物科學國家民委重點實驗室，四川成都 610041）

山羊（Capra hircus）是最古老的家養(yǎng)動物之一，起源于扎格羅斯山脈附近（伊朗地區(qū)），馴化時間大約是一萬年前的新石器時代[1]，此時人類生活方式由狩獵轉(zhuǎn)向農(nóng)耕[2]，山羊能為人類提供穩(wěn)定的肉、奶、毛皮等生活物資，逐漸在經(jīng)濟、文化、宗教上與人類文明建立起密切的關(guān)系[3]。隨著人類的遷移和商業(yè)貿(mào)易，山羊迅速傳播到世界各地。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，全世界有超過579 個山羊品種，山羊存欄量10 億只，中國和印度的山羊共占世界存欄量的32%。

基因組學是解析生物表型變異和遺傳基礎的重要學科，可對生物基因序列進行定位與功能分析[4]。全基因組測序是研究該學科的重要手段，主要集中在從頭組裝測序和重測序2 個方面。其中，重測序手段最為常見，可對已知基因組序列物種的個體或群體進行表型變異分析[5]。為實現(xiàn)早期選擇，降低育種成本，加速山羊的改良進程，本文總結(jié)了山羊全基因組測序相關(guān)理論成果，旨在為后續(xù)山羊功能基因組學研究提供基礎資料，為山羊分子育種工作提供新視角。

1 從頭組裝測序

2013 年，Dong 等[6]利用新一代測序、全基因組酶切圖譜等技術(shù)對云南黑山羊進行深度測序，從頭組裝了首個山羊參考基因組序列CHIR_1.0，完成基因組的結(jié)構(gòu)和功能注釋工作，其中Contig N50 為18 720 bp，Scaffoled N50 為16.3 Mb。2014 年，Du 等[7]利用輻射雜交圖譜等數(shù)據(jù)對CHIR_1.0 進行優(yōu)化，獲得了更準確、更完整的山羊參考基因組 CHIR_2.0（表1）。2015 年，Dong 等[8]又對伊朗野山羊（Capra aegagrus，bezoar）從頭組裝測序，構(gòu)建了野山羊的參考基因組，并家養(yǎng)山羊代表品種的重測序數(shù)據(jù)分析進行比較，發(fā)現(xiàn)毛色相關(guān)基因ASIP存在拷貝數(shù)變異（拷貝數(shù)越高，毛色越淺），CACNA1C與HTR3A基因分別在野山羊和家山羊中快速進化，行為變化由警覺到溫順，推測與馴化有關(guān)。2017 年，隨著三代測序技術(shù)的逐漸成熟，BickHart 等[9]結(jié)合二代 Illumina、三代 Pacbio 單分子測序、光學圖譜BioNano 和Hi-C 等技術(shù)對圣克利門蒂山羊進行從頭組裝，獲得了僅含663 個空白序列的高質(zhì)量山羊基因組精細圖譜ARS1。與之前的組裝版本CHIR_1.0 和CHIR_2.0 相比，ARS1 完善組裝了高度重復的著絲粒和端粒區(qū)域，解決了超過1 kb 的重復結(jié)構(gòu)，不僅為山羊的基因組表型分析提供高質(zhì)量的遺傳信息，也為其他物種基因組的裝配提供參考。

表1 山羊不同版本的參考基因組比較

2 基因組重測序

2.1 生理特征 山羊的馴化是多起源的[10-11]。馴化后的山羊隨著人類活動快速擴散并成功適應不同生態(tài)地區(qū)，極具地域特色。如生存在炎熱沙漠地區(qū)的Draa 山羊頻繁喘息，為解釋這一現(xiàn)象，Benjelloun 等[12]對Black、Draa 和Northern 3 個種群共36 只山羊全基因組掃描分析，在Draa 山羊群體中發(fā)現(xiàn)呼吸系統(tǒng)調(diào)節(jié)和氣體交換類別的GO 條目富集，可能與Draa 山羊利用喘氣散熱有關(guān)。西藏絨山羊可在高寒缺氧的惡劣生存環(huán)境中生存繁衍，為闡釋其表型適應的遺傳機制，Song 等[13]對330 只絨山羊外顯子進行測序分析，結(jié)果表明，EPAS1、PTPRJ、DSG3等心血管系統(tǒng)相關(guān)基因可能在高海拔適應性中發(fā)揮重要作用。后續(xù)針對低海拔和高海拔山羊種群的DSG3基因16 個外顯子重測序分析也佐證了這一觀點[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)，CDK2、SOCS2、NOXA1、ENPEP基因也與高海拔適應性密切相關(guān)[15]。土著山羊雖生產(chǎn)性能較低，但對當?shù)貝毫拥纳姝h(huán)境或特定的疾病具有耐受性。據(jù)報道，烏干達本土山羊增強自身免疫能力以抵御非洲熱帶環(huán)境中寄生蟲的感染[16]；韓國本地山羊群體中發(fā)現(xiàn)了抗腰麻痹病基因（CCR3、CLNK、HM13、IGSF10、ROBO1）和抗沙門桿菌及革蘭氏陰性菌基因（NTMLBP、BPI）[17-18]。這些遺傳標記均是山羊種質(zhì)保護的重要遺傳資源，為山羊品種改良及育種計劃提供了重要基礎。

2.2 羊絨性狀 山羊絨素有軟黃金之稱，其價值由顏色、長度、細度和產(chǎn)量決定。羊絨顏色是單基因控制的質(zhì)量性狀，但其長度、直徑與產(chǎn)量都屬于多基因控制的數(shù)量性狀。因此，探明羊絨性狀的遺傳機制難度較大。

Wang 等[15]對8 個不同地區(qū)的家養(yǎng)山羊品種（太行黑山羊、藏山羊、內(nèi)蒙古絨山羊、陜北絨山羊、安哥拉山羊、波爾山羊、嶗山奶山羊和貴州小山羊）進行表型分析時，鑒定了羊絨性狀候選基因LHX2、FGF9與WNT2。Li 等[19]在80 個絨山羊個體中也掃描到FGF5、ROCK1、PRKCD、SGK3等多個羊絨性狀的候選基因。絨由山羊的次級毛囊產(chǎn)生，LHX2基因調(diào)控毛發(fā)產(chǎn)生與再生[20]，其循環(huán)表達參與山羊次級毛囊的發(fā)育[21]；FGF9 能夠促進毛囊損傷后的再生[22]；WNT2參與毛囊的啟動[23]；ROCK在調(diào)節(jié)人角質(zhì)細胞的增殖和終末分化[24-25]，這些基因均可能是調(diào)控羊絨周期生長的關(guān)鍵基因。白絨因具有極大的可染性被視為最珍貴的羊絨，因此，白色被毛顏色基因MC1R和調(diào)節(jié)毛發(fā)長度的基因FGF5[26]與絨山羊的選擇目的（白色和長纖維）一致。Zhang 等[27]實驗表明，PRDM6基因可能與羊絨性狀有關(guān)，但因基因組測序的樣本量過小，該基因未得到明確的功能注釋。此外，66K SNP 捕獲芯片雖在內(nèi)蒙古絨山羊（二狼山型）群體中篩選出AKT1、ALX4、HK1和NT-34 個絨毛細度性狀的候選基因[28]。但目前商業(yè)化山羊SNP 芯片均是基于少數(shù)幾個品種全基因組測序數(shù)據(jù)設計而成，并不適配所有山羊品種。因此，全基因組測序研究的不斷深入有利于商業(yè)化SNP 芯片的設計，從而提高山羊性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的準確性。

為加速高產(chǎn)絨山羊品種選育進程，吳海青等[29]在同一群體中選擇高產(chǎn)絨量（＞1 000 g）和低產(chǎn)絨量（＜480 g）的母羊各3 只進行基因組重測序，選擇性消除分析高產(chǎn)組和低產(chǎn)組的全基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CUL1、FBXL3、YY1和EZH2基因參與調(diào)控絨山羊次級毛囊發(fā)育的重要信號通路。

羊絨品質(zhì)直接受遺傳因素影響，不同品種的羊絨品質(zhì)差異極顯著[30]。除遺傳因素調(diào)控外，環(huán)境和營養(yǎng)對羊絨的品質(zhì)和產(chǎn)量影響顯著[31-32]。上述研究加深了人們對羊絨性狀的了解，但并未完全解析羊絨性狀的遺傳基礎。因此，對受外界因素影響的絨山羊次級毛囊進行轉(zhuǎn)錄組分析可能是強有力的手段[33-34]。蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)生理功能的執(zhí)行者，毛囊以及皮膚中微環(huán)境對絨毛的生長發(fā)育、凋亡至關(guān)重要。利用蛋白組學了解毛囊生長周期相關(guān)的功能蛋白對絨毛的性狀、產(chǎn)量和質(zhì)量的調(diào)節(jié)也具有十分重要的意義[35]。

2.3 繁殖性狀 繁殖特征是山羊產(chǎn)業(yè)重要的經(jīng)濟指標。山羊的繁殖性狀是多基因和多因素共同調(diào)控的數(shù)量性狀，遺傳力較低，采用傳統(tǒng)的育種技術(shù)很難對其改良。目前我國只有濟寧青山羊、大足黑山羊、川中黑山羊等少數(shù)幾個高繁殖力山羊品種，探明山羊繁殖性狀的遺傳機理對山羊的分子育種具有理論指導意義。

近年來雖然已發(fā)現(xiàn)較多與繁殖相關(guān)的候選基因，但山羊的繁殖力研究未取得突破性進展。其原因可能是山羊繁殖性狀涉及多個基因、位點的相互作用[36]。因此，利用全基因組測序技術(shù)分析多基因與多位點對繁殖性狀的調(diào)控作用尤為必要。Lai 等[37]分別對嶗山奶山羊高、低繁殖力的2 個極端種群進行基因組重測序，分別鑒定12 458 711 和12 423 128 個SNP，CCNB2、AR、ADCY1、DNMT3B、SMAD2、AMHR2、ERBB2、FGFR1、MAP3K12和THEM4在高繁殖力組中被特異性選擇，KDM6A、TENM1、SWI5和CYM在低繁殖力組中被特異性選擇。Lai 等[37]還認為基因外顯子區(qū)域SNP 可能對山羊產(chǎn)羔數(shù)至關(guān)重要，統(tǒng)計分析非同義突變的同源SNP 發(fā)現(xiàn)高繁殖力組中僅鑒定出SETDB2基因c.C1540T 非同義突變，且該突變可能由人工選擇壓力導致；2 組共有候選基因的多個非同義SNP 在群體間具有較強的遺傳分化，如低繁殖力組CD3D基因中c.A65G，高繁殖力組CDH26基因中c.A1063G、c.G1035A、c.T1034C，以及EML1基因c.G560A 突變，均可能在奶山羊繁殖力調(diào)控中發(fā)揮重要作用。也有研究表明，基因表達調(diào)控的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSSs）周圍SNP 分布和基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）也可能影響嶗山奶山羊產(chǎn)羔數(shù)[38-39]。

以大足黑山羊為實驗動物，在第3 胎產(chǎn)羔數(shù)的基礎上，分別構(gòu)建高產(chǎn)山羊群體（產(chǎn)羔3～5 只）和低產(chǎn)山羊群體（產(chǎn)羔1～2 只）基因組混池，通過混池重測序掃描山羊重要基因組區(qū)域及與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因，共鑒定96 個候選基因，包括NR6A1、STK3、IGF2BP2、AR、HMGA2、NPTX1、ANKRD17、DPYD、CLRB、PPP3CA、PLCB1、STK3和HMGA2，通過信號通路的功能分類與注釋對候選基因進行分析發(fā)現(xiàn)，一些新的候選基因富集在生殖相關(guān)的通路中，如雌激素信號通路和卵母細胞減數(shù)分裂[40]。Wang 等[41]對濟寧青山羊群體按第1 胎產(chǎn)羔數(shù)1、2、3 只分成3 組進行全基因組掃描，具有最高選擇特征的候選基因雙羔組為KIT、KCNH7、KMT2E，3 羔組為PAK1、PRKAA1、SMAD9，同時，在細胞程序性死亡參與細胞發(fā)育的功能條目和胰島素受體調(diào)控的通路中，42 個候選基因的表達最為豐富，其中還包括類固醇代謝過程的生殖相關(guān)通路和激素刺激的細胞反應。這些候選基因涉及到山羊產(chǎn)羔數(shù)的調(diào)節(jié)，多個基因富集在雌激素信號通路和類固醇代謝過程的生殖相關(guān)通路中，暗示激素參與調(diào)節(jié)山羊產(chǎn)羔數(shù)的重要性。這些候選基因的發(fā)現(xiàn)拓展了人們對繁殖力遺傳基礎的認識，為繁殖性狀的研究提供重要線索。

山羊的季節(jié)性繁殖雖沒有綿羊明顯，但發(fā)情配種也多集中在秋季。光照信息通過視覺接收后經(jīng)視交叉上核傳入松果體，調(diào)節(jié)松果體褪黑素的分泌[42-44]。褪黑素調(diào)控下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）等激素的釋放，從而影響配子的發(fā)生與性腺生殖激素分泌[45-46]。因此，季節(jié)性光照是決定山羊季節(jié)性繁殖活動的重要因素。管代祿[47]對年光照時間差異極顯著的大足黑山羊（1 279 h）與內(nèi)蒙古絨山羊（3 000～3 400 h）進行全基因組測序，篩選到光感受活性和藍光感受活性的關(guān)鍵基因BIRC6可能是調(diào)控山羊季節(jié)性繁殖的關(guān)鍵基因。下丘腦是調(diào)控動物季節(jié)性繁殖的關(guān)鍵部位，不同光照時長條件下的山羊下丘腦轉(zhuǎn)錄組中差異表達基因TACR1、TACR2、TACR3在山羊季節(jié)性繁殖活動中可能發(fā)揮重要作用[48]。

Guo 等[49]利用比較種群基因組學在多胎美姑黑山羊群體中發(fā)現(xiàn)的基因KHDRBS2；Berihulay 等[50]在埃塞俄比亞本地山羊群體基因組數(shù)據(jù)掃描到強選擇信號基因CAMK2D、KANK4 NIN、RSPH6A和UGT2A2；努比亞山羊、隆林山羊和努隆雜交山羊F1代家系的表型差異基因ADAM2、ADAM18、AZIN2和RAN[51]，均在山羊的繁殖過程中發(fā)揮重要作用。SRD5A2、MSMB、STAR和3BHSD等基因以及多個miRNA 在卵巢中的高表達與金堂黑山羊的多羔性狀相關(guān)[52-53]。

綜上，山羊高繁性狀調(diào)控基因的高通量測序挖掘雖取得較大進展，但并未找其主效基因。筆者認為其原因是山羊的繁殖性狀由多個主效基因共同調(diào)控，各主效基因間可能存在平行或者互作關(guān)系。因此，山羊繁殖性狀的候選基因調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建，仍有待基因組測序工作的深入挖掘。

2.4 產(chǎn)肉性狀與產(chǎn)奶性狀 隨著人們生活水平的提高，纖維細嫩、營養(yǎng)豐富、風味獨特的羊肉逐漸受到人們的喜愛。山羊的產(chǎn)肉性狀是重要的經(jīng)濟性狀。Zhang 等[27]對不同用途的品種山羊（雷州山羊、薩能奶山羊和遼寧絨山羊）進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)在肉用山羊群體中強選擇信號基因（HMGXB3、SLC26A2、HITA1、SLC35A3、LPR4等）。除部分基因參與山羊的體型大小和骨骼發(fā)育[54]，剩余基因具體功能還需進一步探明，可能與參考山羊基因組功能和結(jié)構(gòu)并未完全注釋有關(guān)，但這些基因也為肉用山羊的經(jīng)濟性狀研究提供了新思路。TGF4、ACACA、LPL基因是努比亞山羊的產(chǎn)肉性狀的關(guān)鍵調(diào)控基因[51]。之前研究表明，TGF4基因與西門塔爾牛的屠宰率和凈肉率性狀顯著相關(guān)[55]，ACACA是反芻動物肌肉沉積的主要因素，其表達水平與總脂肪酸和反式脂肪酸呈正相關(guān)[56]，LPL基因編碼甘油三酯水解為游離脂肪酸的關(guān)鍵酶。TGF4、ACACA和LPL基因可能分別在努比亞山羊的產(chǎn)肉率、肉品質(zhì)和風味方面發(fā)揮重要作用。

奶是人類膳食中一種重要的蛋白來源，其含有豐富的營養(yǎng)成分與生物活性物質(zhì)，對新生哺乳動物的健康成長至關(guān)重要。乳脂、乳蛋白是衡量產(chǎn)奶性狀的重要指標?，敼蚚57]初步鑒定5 個調(diào)控山羊產(chǎn)奶性狀的候選基因，后續(xù)利用這些基因的保守SNP 位點擴群驗證，與產(chǎn)奶量關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果提示EIF4G1、VPS13C均可能是調(diào)控山羊產(chǎn)奶性狀的關(guān)鍵基因，且EIF4G1基因中g(shù).9003G＞A 位點有望作為奶山羊高產(chǎn)量的分子遺傳標記。也有研究發(fā)現(xiàn)，RPL3、VPS13C等基因?qū)λ_能奶山羊的泌乳至關(guān)重要[27]。

迄今為止，肉用山羊與奶山羊群體的全基因組測序研究較少，需進一步深入。蛋白組學、轉(zhuǎn)錄組學分析技術(shù)的應用，也有利于山羊產(chǎn)肉、產(chǎn)奶性狀功能基因的挖掘與定位[58-61]。

3 展 望

目前，基因組測序工作雖可深層次揭示山羊基因組蘊藏的遺傳信息，加深人們對山羊基因組和功能關(guān)系的認識，但部分工作仍有待推進：①山羊參考基因組需繼續(xù)完善；②消除假陽性信號、精確鑒定山羊性狀調(diào)控基因的大樣本深度測序工作有待進行；③基于基因組測序已公布的SNP 位點和候選基因等遺傳標記應用于山羊奶、肉品質(zhì)的改良等品種培育工作，還需不斷實踐驗證；④為闡明山羊性狀的復雜遺傳機制，以全基因組測序為基礎，多組學協(xié)同構(gòu)建和完善“突變-基因-表達-蛋白”生物過程的工作有待開展。多組學時代下的生命科學研究，全基因組測序不僅是探究生物表型變異的技術(shù)手段，更是多組學協(xié)同闡釋遺傳變異機理工作的基石。可考慮大規(guī)模深入開展全基因組測序研究，從而發(fā)揮其基石作用，加速山羊分子育種進程。