堿提酸沉法提取漢麻籽蛋白粉的優(yōu)化

石杰，宋淑敏，魏連會，楊慶麗，董艷，姬妍茹

黑龍江省科學(xué)院大慶分院（大慶 163319）

漢麻（Cannabis SativaL.）是我國麻類產(chǎn)業(yè)研發(fā)的主導(dǎo)作物，也是近年來我國麻類產(chǎn)業(yè)進(jìn)程中發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)。漢麻種子的開發(fā)利用不僅對漢麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著重要作用，同時也為人們提供一種具有豐富營養(yǎng)和保健價值的食物資源，關(guān)于漢麻籽保健食品的研究與開發(fā)成為產(chǎn)業(yè)熱點之一。有研究表明漢麻籽是一種十分優(yōu)異的蛋白來源，不含大豆寡聚糖和致敏因子，并且可以促進(jìn)人體產(chǎn)生膠原蛋白，不會造成胃脹、反胃和過敏反應(yīng)[1]。漢麻籽蛋白的分離方法主要有減提酸沉、水酶法、反膠束和膜分離法以及高壓均質(zhì)法。其中，水酶法的成本較高，部分蛋白質(zhì)在提取過程中會被改性[2]，反膠束和膜分離法是一種較新的分離方法，生產(chǎn)的蛋白粉雖然純度較高，但設(shè)備較貴，產(chǎn)率較低，操作復(fù)雜[3-4]，而高壓均質(zhì)法不但提取率低且雜質(zhì)率高[5]。因此，可用于批量生產(chǎn)漢麻蛋白的主要是堿提酸沉法，但仍需要探索和優(yōu)化提取條件以提高漢麻蛋白產(chǎn)率。通過單因素試驗和正交試驗確定和優(yōu)化脫脂漢麻粕提取漢麻籽蛋白的方法，以獲得高純度的漢麻籽蛋白粉。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂漢麻粕（錦州俏牌生物技術(shù)有限公司）。

石油醚、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、硫酸、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純試劑）；去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司）；GL10M大型離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；CT15RT臺式高速冷凍離心機(jī)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；VFD-6000真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；MS300加熱式恒溫電動磁力攪拌器（上海般特）；UV759S紫外-可見光分光光度計（上海精科）。

1.3 試驗方法

1.3.1 漢麻分離蛋白的制備工藝（單因素試驗）

1.3.1.1 工藝路線

漢麻脫脂粉→石油醚再次脫脂→堿液提取→離心→上清液酸沉→離心→沉淀水洗→凍干→漢麻分離蛋白粉

1.3.1.2 操作要點

脫脂漢麻籽粕經(jīng)粉碎、過篩后獲得漢麻脫脂粉，與去離子水按1∶20（g/mL）料液比進(jìn)行混合，用1.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)料液至所需pH，放置于磁力攪拌器上，設(shè)定提取時間，在一定溫度下進(jìn)行堿提。堿提結(jié)束后，在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，保留上清液。測定上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，比較不同堿提工藝條件下的蛋白提取率。對得到的漢麻籽蛋白上清液，用1.0 mol/L的HCl調(diào)節(jié)至所需pH，在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，棄去上清液（同時測定上清液存留的蛋白質(zhì)濃度，以計算沉淀率），將沉淀的蛋白融入去離子水中，調(diào)節(jié)pH 6.0~7.0，得到漢麻籽蛋白凝乳，真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥。獲得漢麻籽蛋白粉。

1.3.2 制備漢麻分離蛋白的工藝優(yōu)化

在前期漢麻籽蛋白堿提單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗對堿提pH、提取溫度、提取時間、酸沉pH這4個影響因子進(jìn)行優(yōu)化，比較不同工藝條件下的蛋白提取率和沉淀率，按式（1）和（2）計算。

蛋白提取率=堿提上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/原料中蛋白質(zhì)質(zhì)量×100% （1）

蛋白沉淀率=100-酸沉上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/堿提上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量×100% （2）

表1 漢麻籽蛋白提取條件正交設(shè)計因素水平表

1.4 蛋白質(zhì)濃度測定方法

采用Bradford法。

1.5 蛋白質(zhì)粉含量測定方法

采用凱氏定氮法。

2 結(jié)果與分析

2.1 漢麻分離蛋白提取單因素試驗

2.1.1 堿提pH對漢麻分離蛋白沉淀率及提取率的影響溶液pH改變會直接影響兩性分子蛋白質(zhì)的表面帶點情況，從而影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-溶劑間的相互作用，而使蛋白質(zhì)的溶解性發(fā)生改變。

圖1 顯示，隨著pH升高，漢麻分離蛋白的提取率逐漸升高，但pH＞10.5時升高的速率減慢，變化不明顯，趨于平緩。強堿條件不僅會增加堿液用量，還可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)中賴氨酸與丙氨酸或胱氨酸發(fā)生縮合反應(yīng)，影響蛋白品質(zhì)。結(jié)合隨著提取pH升高，蛋白沉淀率在酸性體系中略有下降，因此堿提pH選取10.5左右。

圖1 不同堿提pH下漢麻分離蛋白沉淀率與提取率的變化

2.1.2 酸沉pH對漢麻分離蛋白沉淀率及提取率的影響

酸沉即向浸提液中加入稀鹽酸，將其pH達(dá)蛋白質(zhì)的等電點附近，使浸提液中的蛋白質(zhì)沉淀析出，與糖類、酚類等可溶性成分分離。漢麻蛋白在不同pH下的沉淀率和提取率見圖2。

由圖2可見，在酸沉pH 3.5~5范圍內(nèi)，蛋白沉淀率和提取率變化非常接近，這是由于堿液提取導(dǎo)致多種蛋白質(zhì)組分同時溶出，而不同蛋白質(zhì)有不同的等電點所致?？紤]到過酸不但增加成本，還可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，所以選取較溫和的pH 5.0為酸沉pH。

圖2 不同酸沉pH下漢麻分離蛋白沉淀率與提取率的變化

2.1.3 提取時間對漢麻分離蛋白沉淀率及提取率的影響

由圖3可知，提取時間對漢麻分離蛋白的沉淀率和提取率影響甚小，在50~90 min沉淀率和提取率均只相應(yīng)變化約8%。這主要是緣于漢麻蛋白質(zhì)的組成特點，清球蛋白溶解性較好。綜合考慮生產(chǎn)成本和工藝周期，選定提取率最高的70 min作為最適提取時間。

圖3 不同提取時間下漢麻分離蛋白沉淀率與提取率的變化

2.1.4 提取溫度對漢麻分離蛋白沉淀率及提取率的影響

蛋白質(zhì)在不同溫度下有不同的溶解度，為提高蛋白質(zhì)提取率，有必要測定溫度對提取率的影響。由圖4可知，隨著溫度提高，提取率逐漸上升，沉淀率變化不大。但過高的溫度會導(dǎo)致漢麻蛋白的變性。因此，選擇60 ℃作為最佳提取溫度。

圖4 不同提取溫度下漢麻分離蛋白沉淀率與提取率的變化

2.2 正交試驗優(yōu)化漢麻分離蛋白的最佳提取工藝

料液比1∶20（g/mL），不同堿提pH、提取溫度、提取時間條件下按4 000 r/min離心20 min，測定上清液中蛋白質(zhì)濃度，不同pH條件下酸沉，測定上清液中蛋白質(zhì)濃度。

從表2的正交試驗結(jié)果可以看出沉淀率和提取率的提取條件影響大小都是A＞C＞B＞D，即堿提pH＞提取溫度＞酸沉pH＞提取時間，為提高漢麻蛋白沉淀率，可選取的最佳提取工藝為堿提pH 10，酸沉pH 5，提取溫度60 ℃，提取時間70 min。漢麻分離蛋白提取率的最佳工藝條件為pH 10.5，酸沉pH 4.5，提取溫度60 ℃，提取時間70 min。沉淀率達(dá)到64.29%，提取率為63.54%。

表2 漢麻分離蛋白提取條件正交設(shè)計試驗結(jié)果

2.3 提取工藝優(yōu)化過程中漢麻分離蛋白含量監(jiān)測

通過采用優(yōu)化的提取工藝制備漢麻分離蛋白，課題組使用凱氏定氮法分別測定脫脂漢麻籽粕、堿提凍干后提取的蛋白粉、酸沉凍干后提取的蛋白粉及沉渣凍干后蛋白粉的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見表3。

由表3可知，堿提酸沉法可以提取出多數(shù)漢麻分離蛋白，但仍有很多蛋白存留于殘渣中。同時有非蛋白物質(zhì)溶解于堿提溶液中，并僅有部分在酸沉?xí)r與漢麻蛋白同時沉淀下來。

表3 漢麻分離蛋白含量過程監(jiān)測數(shù)據(jù)

3 結(jié)論與討論

影響堿提酸沉沉淀率和提取率的條件中，堿提pH＞提取溫度＞酸沉pH＞提取時間，漢麻分離蛋白提取率的最佳工藝條件為pH 10.5，酸沉pH 4.5，提取溫度60 ℃，提取時間70 min。沉淀率達(dá)到64.29%，提取率為63.54%。堿提酸沉可以獲得純度90%以上的蛋白質(zhì)粉，雖然仍有部分蛋白損失的現(xiàn)象，但已是工業(yè)化提純蛋白質(zhì)的最佳方式，試驗為探索更好的漢麻蛋白質(zhì)批量提純方法提供數(shù)據(jù)支撐。