陳 浩, 李慧利, 杜 亮, 周長浩, 陳 歡, 王 欣
(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院麻醉手術科,河北石家莊 050031)
膿毒癥由感染引發(fā),患者全身發(fā)生有害反應,會出現(xiàn)低血壓、惡病質(zhì)和發(fā)熱等癥狀,嚴重影響生命安全,危害嚴重[1]。膿毒癥會導致炎癥因子和自由基增多、出現(xiàn)線粒體損傷等,這些情況均導致細胞自噬增多,而自噬在膿毒癥中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[2]。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)自噬通路作為上游通路匯合點,在膿毒癥大鼠中對于自噬調(diào)控發(fā)揮重要作用[3]。膿毒癥中激活自噬可以抑制炎癥反應,從而減少細胞死亡,減輕患者癥狀[4]。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)作為α2受體激動藥物,對膿毒癥患者有保護作用,可降低28 d死亡率和縮短機械通氣時間[5],但作用機制尚需進一步探討。因此,本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(cecal ligation and puncture,CLP)建立膿毒癥大鼠模型,探究DEX 對自噬及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體的作用,以期尋找DEX緩解膿毒癥的機制。
50 只SPF 級雄性Wistar 大鼠,10 周齡,體質(zhì)量(200±10)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016-0011。所有大鼠均在溫度(23.5±0.5)℃、濕度(50±5)%、12 h黑暗/12 h 光照條件下自由飲水攝食,暫養(yǎng)1 周后進行實驗,實驗動物符合3R 原則。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院動物倫理審查委員會審核并通過。
鹽酸DEX注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;國藥準字H20090248;規(guī)格:2 mL、200 μg);PI3K/mTOR 抑制劑NVP-BEZ235(MedChemExpress;規(guī)格:200 mg;純度:99.68%);自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA;Sigma;規(guī)格:100 mg);蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);大鼠白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、兔源Ⅰ抗[beclin-1、LC3-II、Akt、磷 酸 化(phosphorylated,p)-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、含caspase 募集結(jié)構域的凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)及caspase-1 及其前體pro-caspase-1、GAPDH]及Ⅱ抗羊抗兔IgG(Abcam)。光學顯微鏡(深圳市隆基金相儀器設備有限公司,型號:LJ-JX2030);透射電鏡(Thermo Scientific,型號:Talos);蛋白凝膠成像儀(北京中西華大科技有限公司,型號:JY02G)。
3.1 分組及處理 將大鼠分成假手術(sham operation,sham)組、模型(model)組、DEX 組、DEX+NVPBEZ235組和DEX+3-MA組,每組10只。除假手術組外,其余各組參考文獻[6]采用CLP建立膿毒癥大鼠模型:大鼠術前禁食但不禁水,麻醉大鼠,大鼠仰臥固定在鼠板上,腹腔經(jīng)消毒后在正中切開約1.5 cm 切口,找出盲腸,結(jié)扎回盲瓣及遠端盲腸,無菌注射器針頭在結(jié)扎處與盲腸末端中點處做2 次貫通穿孔,擠出腸內(nèi)容物,盲腸連同擠出的腸內(nèi)容物一同回納腹腔,逐層縫合切口。假手術組大鼠除了不結(jié)扎穿孔盲腸外其余處理相同。造模結(jié)束后DEX組、DEX+NVP-BEZ235 組和DEX+3-MA 組分別在0、3 和6 h 腹腔 注 射10 μg/kg DEX[7],DEX+NVP-BEZ235 組 在DEX 組基礎上腹腔注射30 mg/kg NVP-BEZ235,DEX+3-MA 組在DEX 組基礎上腹腔注射15 mg/kg 自噬抑制劑3-MA。
3.2 樣品采集 造模24 h,腹主動脈采血,斷頭法處死大鼠,收集腸道組織,部分置于4%多聚甲醛中固定、部分置于-80 ℃冰箱保存。
3.3 HE 染色觀察腸道組織形態(tài)和肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài) 4%多聚甲醛中固定組織,梯度乙醇脫水后進行常規(guī)包埋、切片、貼片、烤片,切片(厚度5 μm),切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水,晾干后蘇木精染色、0.1%鹽酸酒精分化、伊紅復染,乙醇脫水、二甲苯透明后封片,光學顯微鏡下觀察腸道組織形態(tài)。另外,肉眼觀察大鼠結(jié)腸標本,進行結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)(colon macroscopic damage index,CMDI)評分。評分標準:0 分,無損傷;1 分,輕度水腫、充血,表明光滑、無糜爛;2分,充血、水腫,組織表面呈顆粒狀,有糜爛或腸黏連;3分,高度水腫、充血,黏膜表明壞死或潰瘍,潰瘍最大縱徑<10 mm,腸壁增厚或表面壞死及炎癥;4 分,在3 分基礎上潰瘍最大縱徑≥10 mm,或出現(xiàn)全腸壁壞死。
3.4 ELISA 檢測血清中IL-1β 和TNF-α 水平 腹主動脈血室溫靜置2 h,1 400×g離心10 min,上清為血清。參考大鼠IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒檢測血清中IL-1β和TNF-α水平。
3.5 免疫組化檢測腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白表達情況 3.3 中切片經(jīng)0.1 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液高溫抗原修復,3% H2O2甲醇溶液封閉抗原,加入beclin-1(1∶100)和LC3-II(1∶250)抗體,4 ℃孵育過夜;37 ℃孵育HRP 標記的山羊抗兔IgG(1∶500),DAB 染色,蘇木素染核。顯微鏡下觀察腸道組織中beclin-1和LC3-II蛋白情況:beclin-1和LC3-II目的蛋白為胞質(zhì)、胞核中棕褐色團狀物質(zhì)。蛋白陽性率(%)=陽性細胞/總細胞×100%。
3.6 Western blot 檢 測 腸 道 組 織 中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、ASC、caspase-1 和pro-caspase-1 蛋白水平 從-80 ℃冰箱中取腸道組織30 mg,手術剪剪碎,添加蛋白裂解液,冰上研磨后冰上裂解20 min,10 000×g、4 ℃離心20 min,BCA 試劑盒測定蛋白濃度,每孔上樣30 μg,凝膠電泳分離蛋白,PVDF 轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;加入Ⅰ抗[Akt(1∶10 000)、p-Akt(1∶500)、mTOR(1∶10 000)、pmTOR(1∶1 000)、NLRP3(1∶1 000)、ASC(1∶1 000)、caspase-1(1∶1 000)、pro-caspase-1(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)];對應加入Ⅱ抗羊抗兔IgG(1∶5 000),室溫孵育2 h。DAB 顯色試劑顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。
數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 7.0 進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,組內(nèi)比較用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
假手術組腸上皮細胞大小均勻一致、排列整齊緊密,層次分明,無明顯病理改變;模型組腸道組織完整性破壞嚴重,存在壞死脫落細胞,炎癥浸潤現(xiàn)象明顯,基底面細胞染色較深,細胞擠壓明顯,游離面細胞有不同程度潰損;DEX 組腸道組織屏障較為完整,細胞形態(tài)清晰,無明顯細胞碎片脫落,炎癥浸潤較輕;DEX+NVP-BEZ235組細胞形態(tài)改變,游離面排列不平整,膠原帶增生明顯,炎癥浸潤明顯;DEX+3-MA 組腸道完整破壞,基底面細胞排列紊亂,膠原帶增厚,細胞形態(tài)破壞嚴重,有較多游離的細胞碎片,見圖1。
Figure 1. The morphological changes of rat intestinal tissues in the 5 groups. A:sham group;B:model group;C:DEX group;D:DEX+NVP-BEZ235 group;E:DEX+3-MA group. The black star indicates the collagen band. The scale bar=100 μm.圖1 各組大鼠腸道組織形態(tài)變化
與假手術組相比,模型組、DEX 組、DEX+NVPBEZ235 組和DEX+3-MA 組CMDI 評分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,DEX 組和DEX+NVP-BEZ235組CMDI 評分顯著降低(P<0.05);與DEX 組相比,DEX+3-MA 組CMDI 評 分 顯 著 升 高(P<0.05),見圖2。
Figure 2. The colon macroscopic damage index(CMDI)in each group. Mean±SD. n=10.#P<0.05 vs sham group;*P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs DEX group.圖2 各組大鼠結(jié)腸標本CMDI評分
與假手術組相比,模型組、DEX 組、DEX+NVPBEZ235 組和DEX+3-MA 組血清中IL-1β 和TNF-α 水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,DEX 組和DEX+NVP-BEZ235 組血清中IL-1β 和TNF-α 水平顯著降低(P<0.05),DEX+3-MA 組血清中IL-1β水平顯著 降 低(P<0.05);與DEX 組 相 比,DEX+NVPBEZ235 組和DEX+3-MA 組血清中IL-1β 和TNF-α 水平顯著升高(P<0.05),見圖3。
Figure 3. Comparison of serum levels of IL-1β and TNF-α in the 5 groups. Mean±SD. n=10.#P<0.05 vs sham group;*P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs DEX group.圖3 5組血清中IL-1β和TNF-α水平比較
與假手術組相比,模型組、DEX 組、DEX+NVPBEZ235 組和DEX+3-MA 組腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率升高(P<0.05);與模型組相比,DEX 組腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率升高(P<0.05),DEX+3-MA 組腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率降低(P<0.05);與DEX 組相比,DEX+NVP-BEZ235 組和DEX+3-MA 組腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率降低(P<0.05);與DEX+NVP-BEZ235 組相比,DEX+3-MA 組腸道組織中beclin-1蛋白陽性率降低(P<0.05),見圖4。
Figure 4. The protein expression of beclin-1 and LC3-II in intestinal tissues of the rats in the 5 groups was detected by immunohistochemical staining(scale bar=100 μm). Mean±SD. n=10.#P<0.05 vs sham group;*P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs DEX group;△P<0.05 vs DEX+NVP-BEZ235 group.圖4 免疫組化檢測各組大鼠腸道組織中beclin-1和LC3-II蛋白的表達情況
5組腸道組織中Akt、mTOR 和pro-caspase-1蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與假手術組相比,模型組、DEX 組、DEX+NVP-BEZ235 組和DEX+3-MA組 腸 道 組 織 中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋 白 水 平 升 高(P<0.05);與模型組相比,DEX 組和DEX+NVP-BEZ235組腸道組織中p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白水平升 高(P<0.05),NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平降低(P<0.05),DEX+3-MA 組腸道組織中p-Akt/Akt 蛋白水平升高(P<0.05),NLRP3 和ASC 蛋白水平降低(P<0.05);與DEX 組相比,DEX+NVP-BEZ235 組和DEX+3-MA 組腸道組織中p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋 白 水 平 降 低(P<0.05),NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋 白 水 平 升高(P<0.05);與DEX+NVP-BEZ235 組相比,DEX+3-MA 組腸道組織中NLRP3 蛋白水平升高(P<0.05),ASC蛋白水平降低(P<0.05),見圖5。
Figure 5. The protein levels of Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR,NLRP3,ASC,caspase-1 and pro-caspase-1 in intestinal tissues of the rats in the 5 groups were detected by Western blot. Mean±SD. n=10.#P<0.05 vs sham group;*P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs DEX group;△P<0.05 vs DEX+NVP-BEZ235 group.圖5 Western blot檢測各組大鼠腸道組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、ASC、caspase-1和pro-caspase-1蛋白水平
DEX 作為臨床上常用麻醉藥物輔助劑,在重癥監(jiān)護室可鎮(zhèn)定插管或呼吸機患者,安全性較高,較大劑量也不會損害心、肝、腎等重要器官,危害?。?]。隨著研究深入,在臨床上使用DEX 可以降低炎癥因子,減輕水腫,在膿毒癥中具有較高潛在價值[9],但具體機制尚需進一步研究,為探討其機制進行本研究。在本研究結(jié)果,膿毒癥大鼠腸道組織完整性遭到破壞,細胞脫落和炎癥浸潤現(xiàn)象明顯,出現(xiàn)明顯的病理損傷;經(jīng)DEX治療后大鼠腸道組織恢復完整性,僅存在部分細胞脫落和炎癥浸潤現(xiàn)象,且炎癥因子IL-1β 和TNF-α 水平降低。這提示DEX 能夠修復由于膿毒癥造成的腸道功能破壞,緩解膿毒癥大鼠中的炎癥,具體機制尚需進一步探究。
本研究結(jié)果顯示膿毒癥大鼠腸道組織NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平均處于升高狀態(tài)。NLRP3炎癥小體可活化ASC和caspase-1從而引起促炎因子IL-1β 的成熟和釋放,促進炎癥反應[10];且NLRP3與膿毒癥的多器官損傷關系密切,在膿毒癥大鼠中抑制NLRP3 炎癥小體活化可抑制caspase-1 和IL-1β 釋放,從而穩(wěn)定血管內(nèi)皮鈣黏蛋白,緩解膿毒癥引起的肺損傷[11]。DEX 在膿毒癥患者中能夠減輕NLRP3炎癥小體從而減輕膿毒癥誘發(fā)的腎損傷[12],提示膿毒癥大鼠腸道組織中NLRP3 炎癥小體處于激活狀態(tài),活化的炎癥小體促進促炎因子IL-1β 和TNF-α 的表達,加重炎癥反應。添加DEX 后能夠抑制NLRP3炎癥小體的激活,進而減輕炎癥指標,緩解炎癥損傷。
炎癥損傷導致細胞自噬增多,膿毒癥引發(fā)的多臟器功能衰竭器官中也存在自噬增多現(xiàn)象[13]。Akt/mTOR 通路作為自噬調(diào)節(jié)最經(jīng)典的mTOR 信號轉(zhuǎn)導通路,在膿毒癥大鼠中處于激活狀態(tài),且自噬小體水平升高,機體處于自我保護狀態(tài)[14]。beclin-1 是自噬活化的關鍵因子,LC3是自噬重要標志蛋白[15]。DEX能夠激活Akt/mTOR 通路,降低促炎因子水平,從而減輕七氟醚誘導的大鼠炎癥損傷[16]。本研究中膿毒癥大鼠腸道組織中p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白水平及beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率升高,提示膿毒癥大鼠腸道組織處于自噬激活狀態(tài),但本研究中膿毒癥大鼠腸道組織中炎癥因子水平升高,可能是自噬能力有限,整體上導致炎癥加劇。添加DEX 后p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 的蛋白水平及beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率進一步升高,提示添加DEX 后能進一步促進自噬,自噬清除炎癥因子,緩解炎癥。進一步研究顯示,分別在DEX的基礎上添加Akt/mTOR通路抑制劑和自噬抑制劑后,beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率降低,炎癥因子IL-1β 和TNF-α 水平升高,提示Akt/mTOR 通路抑制劑與自噬抑制劑功能類似,DEX通過激活Akt/mTOR 通路而促進自噬,進而減輕炎癥反應,實現(xiàn)對膿毒癥大鼠腸道組織損傷的緩解。
綜上所述,DEX 能夠激活Akt/mTOR 通路而促進自噬、減輕炎癥,從而實現(xiàn)對膿毒癥大鼠腸道的保護。但DEX與信號通路之間的具體調(diào)控尚需進一步研究。