橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定

楊海燕，胡凱平，宋水林，王廣利，徐 業(yè)，王建國，李小珍*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)產(chǎn)業(yè)處，南昌 330045)

昆蟲生殖系統(tǒng)是內(nèi)生細(xì)菌生長、發(fā)生和繁殖的理想場所，在長期特定環(huán)境的進(jìn)化過程中，昆蟲生殖系統(tǒng)與內(nèi)生細(xì)菌之間相互選擇、相互適應(yīng)，導(dǎo)致不同來源、不同性別、不同發(fā)育階段昆蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌屬種存在差異(Huangetal., 2010)。在昆蟲生殖系統(tǒng)中，不同內(nèi)生細(xì)菌屬種，具有不同生理功能。例如，豆蚜Acyrthosiphonpisum生殖系統(tǒng)共生菌Buchneraaphidicola能促進(jìn)豆蚜的生長和繁殖(Douglas, 1996; Russelletal., 2013)；地中海實蠅Ceratitiscapitata生殖系統(tǒng)中克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca能夠延長成蟲壽命，提高成蟲交配能力(Beharetal., 2008)；伯克氏菌屬Burkholderia能夠促進(jìn)昆蟲生殖系統(tǒng)卵黃生成素的沉積，提高昆蟲的產(chǎn)卵能力(Leeetal., 2017)。因此，研究雌雄昆蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌屬種及內(nèi)生細(xì)菌在性別間的差異，對進(jìn)一步探索昆蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的功能，及其對昆蟲生殖行為和生殖能力的調(diào)控有積極意義。

橘小實蠅Bactroceradorsalis(Hendel)屬雙翅目Diptera實蠅科Tephritidae，是美國、日本和韓國等國家的重要檢疫性害蟲(張彬等, 2008; Wanetal., 2011)。橘小實蠅寄主多，能夠為害柑橘、芒果和楊桃等46科250多種果蔬作物(胡凱平等, 2019; Zidaetal., 2020)；成蟲營兩性生殖，具有極強(qiáng)的繁殖和擴(kuò)張能力，每雌可產(chǎn)卵400～1 800粒，每年可擴(kuò)張50～100 km(Duycketal., 2004; Lietal., 2019)。橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細(xì)菌存在差異，能夠調(diào)控橘小實蠅種群的生殖行為和生殖能力，進(jìn)而影響到種群在田間的發(fā)生、危害與擴(kuò)張(Yaoetal., 2016)。目前橘小實蠅腸道內(nèi)生細(xì)菌已經(jīng)受到科研人員的廣泛關(guān)注(Wangetal., 2011; Wangetal., 2014)；而生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的研究相對較少。僅王莉莉(2011)研究了室內(nèi)飼養(yǎng)的橘小實蠅生殖系統(tǒng)中的細(xì)菌群落，并在雌性成蟲生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)植生拉烏爾菌Raoultellaplanticola、產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacteraerogenes、日溝維腸桿菌E.gergoviae和河生腸桿菌E.amnigenus等10種可培養(yǎng)菌群；而Shietal.(2012)發(fā)現(xiàn)，橘小實蠅雌性生殖系統(tǒng)的5種內(nèi)生細(xì)菌，包括土生拉烏爾菌R.terrigena、產(chǎn)酸克雷伯氏菌K.oxytoca和肺炎克雷伯菌K.pneumoniae等的代謝產(chǎn)物，對橘小實蠅成蟲本身具有一定的引誘作用。這些研究為揭示橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的群落構(gòu)成，分析內(nèi)生細(xì)菌的生理功能提供了信息。

然而，由于橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌群落受眾多外界因素影響，致使特定環(huán)境條件下橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的組成存在差異。本研究以來源于江西贛南臍橙基地、以臍橙為主要食料的橘小實蠅為研究對象，采用LB培養(yǎng)基，對橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，分析菌株16S rRNA基因擴(kuò)增序列，明確橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性與差異，為進(jìn)一步研究橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌在生殖調(diào)控中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 采集橘小實蠅樣本

橘小實蠅樣本采集時間為2018年9月中旬，采集地點(diǎn)為江西贛南臍橙基地(東經(jīng)114°00′～114°40′，北緯25°42′～26°01′)。采集橘小實蠅樣本時，收集攜帶橘小實蠅卵和幼蟲的贛南臍橙果實，帶回江西農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲實驗室，在溫度28℃±1℃、相對濕度60%～90%和自然光照條件下，用贛南臍橙果實果肉組織飼養(yǎng)；老熟幼蟲轉(zhuǎn)移到用高溫消毒后的沙土中，化蛹；成蟲用酵母粉、清水和濃度為15%蜂蜜稀釋液飼養(yǎng)10 d，收集成蟲置于-20℃冰箱中保存、備用。

1.2 提取生殖系統(tǒng)

選取無病變、品相良好的橘小實蠅雌雄成蟲各10頭，無菌水沖洗干凈。在超凈工作臺內(nèi)用75%酒精沖洗2次，每次2 min，倒掉酒精；用無菌水漂洗3次，去除雜質(zhì)；再在加有少量無菌水的培養(yǎng)皿中解剖，取出雌雄成蟲生殖系統(tǒng)，放入2 mL EP管中，加入1 mL無菌水后充分研磨混勻，用于內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)。雌雄成蟲各重復(fù)3次。

1.3 培養(yǎng)生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌

上述配制的菌液，用無菌水按照10-2～10-5進(jìn)行梯度稀釋，移液槍吸取50 μL，置于LB培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒涂布均勻，靜置10 min，將培養(yǎng)基移至32℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)2 d后，用接種環(huán)挑取生長良好的不同形態(tài)或顏色性狀的單菌落，采用稀釋涂布劃線法，在提前準(zhǔn)備好的經(jīng)過滅菌消毒的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，得到單一純菌落。將純化后的菌株轉(zhuǎn)至NA培養(yǎng)基斜面上，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。各稀釋菌液均重?fù)3次。

1.4 觀察菌落的表觀特征

接種環(huán)挑取NA斜面上的純菌株，再次接入LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色、隆起度、邊緣形狀、表面狀態(tài)、光澤、干濕情況、透明度、細(xì)菌形狀、芽孢有無和革蘭氏染色等特征。

1.5 擴(kuò)增16S rRNA基因片段

無菌條件下，挑取NA斜面上的純菌株，接入1 mL高壓滅過菌的NB液態(tài)培養(yǎng)基中，在32℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)3 d。菌液PCR擴(kuò)增反應(yīng)的上游細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和下游細(xì)菌通用引物1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)，均由上海生物工程股份技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共30 μL：10×PCR bufferⅡ(with Mg2+)3.0 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，968GC和L1401各0.5 μL，菌液1 μL，TaKaRaLaTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 24.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃復(fù)性1 min；循環(huán)30次，72℃延伸10 min，4℃保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送美因基因公司檢測并測序。

1.6 分析可培養(yǎng)細(xì)菌屬種

利用DNAstar軟件對得到的序列進(jìn)行編輯、整理，然后在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST數(shù)據(jù)庫檢索和同源性比對，找出同源性最高的序列。利用Clustal X軟件對測序獲得的16S rRNA基因序列和與之近緣的已知序列進(jìn)行多序性匹配排列，確定測試序列代表的細(xì)菌分類地位(Saitou and Nei, 1987; Thompsonetal., 1997)。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的菌落特征

采用LB培養(yǎng)基，從飼養(yǎng)10 d的橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中，培養(yǎng)出具有不同形態(tài)或顏色性狀的細(xì)菌15株。其中，雌性成蟲9株，雄性成蟲6株。不同菌株菌落，顏色多變，但多為白色、灰白色、黃白色或黃色。革蘭氏染色表明，15株細(xì)菌菌落中11株呈革蘭氏染色陰性反應(yīng)，4株呈革蘭氏染色陽性反應(yīng)。顯微鏡觀察顯示，13株細(xì)菌呈桿狀，2種呈球狀(表1)。這些細(xì)菌均可以在32℃條件下生長，培養(yǎng)2～3 d后菌落形態(tài)、顏色性狀明顯。

2.2 可培養(yǎng)細(xì)菌屬種鑒定

以橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)分離培養(yǎng)出來的15株細(xì)菌，分別配制的菌液為模板，對菌株16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送美因基因公司檢測、測序，比對鑒定可培養(yǎng)菌株屬種。

測得的序列提交到NCBI進(jìn)行blast同源性比對，發(fā)現(xiàn)橘小實蠅雌性生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)的9株細(xì)菌來自4門、9屬。變形菌門Proteobacteria內(nèi)有4屬，不動桿菌屬Acinetobacter，蒼白桿菌屬Ochrobactrum、無色桿菌屬Achromobacter和劍菌屬Ensifer；擬桿菌門Bacteroidetes內(nèi)有2屬，金黃桿菌屬Chryseobacterium和鞘脂桿菌屬Sphingobacterium；放線菌門Actinobacteria內(nèi)有2屬，微桿菌屬M(fèi)icrobacterium和細(xì)球菌屬M(fèi)icrococcus；厚壁菌門Firmicutes內(nèi)1屬，芽孢桿菌屬Bacillus。橘小實蠅雄性成蟲生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)的6株細(xì)菌來自3門、6屬。變形菌門內(nèi)有3屬，不動桿菌屬、蒼白桿菌屬和假單胞菌屬；擬桿菌門內(nèi)2屬，金黃桿菌屬和擬桿菌屬Bacteroides；厚壁菌門1屬，芽孢桿菌屬(表2)。

對比分析表明，橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)共有4個相同的細(xì)菌屬，分別是不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、金黃桿菌屬和芽孢桿菌屬。雌性成蟲生殖系統(tǒng)特有的細(xì)菌屬，無色桿菌屬、劍菌屬、鞘脂桿菌屬、微桿菌屬和細(xì)球菌屬；雄性成蟲生殖系統(tǒng)特有的細(xì)菌屬，假單胞菌屬和擬桿菌屬(表2)。

表2 橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)的可培養(yǎng)細(xì)菌屬種

2.3 可培養(yǎng)的優(yōu)勢細(xì)菌屬

橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)細(xì)菌各屬菌株數(shù)量所占比例不同。變形菌門內(nèi)的不動桿菌屬菌株所占比例最高，分別占雌雄成蟲生殖系統(tǒng)菌株數(shù)量的35.00%和31.58%，為可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬。此外，在雌成蟲生殖系統(tǒng)中，蒼白桿菌屬、無色桿菌屬、擬桿菌屬和鞘脂桿菌屬所占比例較高；在雄成蟲生殖系統(tǒng)中，微桿菌屬和芽孢桿菌屬所占比例較高(圖1)。

圖1 橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)不同細(xì)菌屬的比例

3 結(jié)論與討論

本研究從橘小實蠅雌性成蟲生殖系統(tǒng)中，分離培養(yǎng)出內(nèi)生細(xì)菌9株，分別是不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、無色桿菌屬、劍菌屬、金黃桿菌屬、鞘脂桿菌屬、微桿菌屬、細(xì)球菌屬和芽孢桿菌屬；從雄性成蟲生殖系統(tǒng)中，分離培養(yǎng)出內(nèi)生細(xì)菌6株，分別是不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、假單胞菌屬、金黃桿菌屬、擬桿菌屬和芽孢桿菌屬。這與王莉莉(2011)從橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中分離培養(yǎng)出的內(nèi)生細(xì)菌屬種存在差異?？赡茉?，一是本研究種群來源于江西贛南臍橙基地，以臍橙為主要食料，飼養(yǎng)到成蟲后直接研究細(xì)菌屬種構(gòu)成；而王莉莉(2011)的研究種群來源于廣東出入境檢驗檢疫部門，以香蕉為主要食料，且在室內(nèi)飼養(yǎng)多代。二是分離培養(yǎng)條件不一致，雖然都采用了LB培養(yǎng)基，但培養(yǎng)基的制備、培養(yǎng)的溫度和時間設(shè)置存在差異。三是測試方法亦存在差異，本研究通過擴(kuò)增16S rRNA基因片段，然后分析鑒定細(xì)菌屬種；而相關(guān)研究則采用高通量測序技術(shù)來分析橘小實蠅生殖系統(tǒng)細(xì)菌屬種(王莉莉, 2011)。因此，研究材料來源、分離培養(yǎng)和測試方法的差異，決定本研究與前人的研究結(jié)果并不一樣。

本研究結(jié)果表明，橘小實蠅雌性成蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細(xì)菌門、屬，均比雄性多。昆蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細(xì)菌與昆蟲的性別、發(fā)育階段以及昆蟲所處的外界環(huán)境條件密切相關(guān)(Beharetal., 2008; Sharonetal., 2010)。由于實驗所用的橘小實蠅成蟲的發(fā)育階段一致且來自同一采樣地點(diǎn)，具有相似的發(fā)育階段和外界條件。因此，本研究橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的屬種變化，可能與橘小實蠅的性別有關(guān)。

橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)均含有不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、金黃桿菌屬和芽孢桿菌屬，其中不動桿菌屬為優(yōu)勢可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌屬。除橘小實蠅外，研究證實不動桿菌屬在南瓜實蠅B.tau(駱米娟等, 2016)和按實蠅Anastrephaludens腸道(Lyudmilaetal., 2001)、澤蘭實蠅Procecidocharesutilis幼蟲體內(nèi)(蘭明先等, 2018)、番石榴實蠅B.orrecta成蟲體內(nèi)(戴陽等, 2020)等多種雙翅目昆蟲中具有分布。因此，可認(rèn)為不動桿菌屬在雙翅目實蠅科昆蟲中普遍存在。有報道，蒼白桿菌屬在番石榴實蠅成蟲體內(nèi)具有分布(戴陽等, 2020)；芽孢桿菌屬在澤蘭實蠅幼蟲體內(nèi)具有分布(蘭明先等, 2018)；但未查到相關(guān)文獻(xiàn)，金黃桿菌屬在相關(guān)實蠅昆蟲體內(nèi)具有分布。

橘小實蠅雌成蟲特有的細(xì)菌有無色桿菌屬、鞘脂桿菌屬、微桿菌屬、細(xì)球菌屬和劍菌屬。其中，無色桿菌屬和細(xì)球菌屬在瓜實蠅B.cucurbitae體內(nèi)有分布(姚明燕等, 2017)；鞘脂桿菌屬、微桿菌屬和細(xì)球菌屬在多種鱗翅目昆蟲棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis、菜青蟲Pierisrapae和甜菜夜蛾Spodopteraexergual腸道中發(fā)現(xiàn)，鞘脂桿菌屬能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡(楊焊, 2012)；劍菌屬多在植物尤其是豆科植物中廣泛分布，與植物固氮作用有關(guān)(陳文峰, 2016)，昆蟲中未查到相關(guān)文獻(xiàn)。雄成蟲特有的細(xì)菌屬有假單胞菌屬和擬桿菌屬。研究證實，假單胞菌屬在墨西哥實蠅(Lyudmilaetal., 2001)和南瓜實蠅雄成蟲(駱米娟等, 2016)體內(nèi)亦有分布，能抵御有害病原真菌的侵入與危害(Indiragandhietal., 2007)；擬桿菌屬在100 Gy137Cs輻照后的瓜實蠅腸道亦有發(fā)現(xiàn)(姚明燕等, 2017)。至于這些特異性細(xì)菌屬種在橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中所起的作用，目前仍不清楚。

本研究從橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)，分離出不同性狀的細(xì)菌15株，分屬4門，11屬，明確雌雄間內(nèi)生細(xì)菌屬種存在差異。仍需要從二方面進(jìn)行研究，一方面是需要根據(jù)細(xì)菌屬種的營養(yǎng)需求和生化特點(diǎn)，來設(shè)計針對性的培養(yǎng)基類型，從而分離純化更多可培養(yǎng)的細(xì)菌屬種；另一方面需要對分離純化的各細(xì)菌屬種的生化特點(diǎn)和生物學(xué)功能進(jìn)行研究、探索。本研究對橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌屬種的比較研究，為優(yōu)化培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件、探索生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)菌的代謝和功能提供信息。